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研究背景角膜上皮细胞(Comeal epithelial cells,CECs)位于角膜的最外层,不仅作为抵御外源性病原体侵袭的第一道物理屏障,也是一道重要的免疫屏障,其通过表达多种模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)参与角膜抵御细菌、病毒等微生物入侵的天然性免疫和获得性免疫过程。Toll样受体家族(Toll like receptors,TLRs)是一类分布广泛的PRRs,主要依赖识别病原体相关分子模式(Pathogen Associated Molecular Patterns,PAMPs),激活髓样分化因子(myeloiddifferentiationfactor88,Myd88)依赖/非依赖性信号通路,启动机体先天性免疫反应,是沟通天然性免疫反应和获得性免疫反应的桥梁。TLRs可通过识别肽聚糖(Peptidoglycan,PGN)、LPS、脂磷壁酸等外源性配体和HSP70、HMGB1等内源性配体,参与清除病原微生物及调控炎症反应的发展。其中,Toll样受体2(Toll like receptor 2,TLR2)是TLRs中表达范围最广泛的受体,成为目前研究的热点。角膜上皮层内特异性免疫细胞如树突状细胞(Dendritic cells,DCs)也参与角膜获得性免疫反应,DCs是机体抗原提呈能力最强大的专职抗原递呈细胞(Antigen presenting cells,APC)。正常角膜上皮内的DCs主要以未成熟形式(imDCs)存在于角膜周边区,当角膜出现炎症反应时,角膜周边区的imDCs往角膜中央区聚集并不断成熟,具备激活T淋巴细胞等功能。DCs成熟受到多种内源性和外源性因素调节,研究发现,TLRs信号可以通过上调MHCⅡ和协同刺激分子、炎症细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-12等触发DCs成熟。然而,迄今为止对角膜上皮细胞TLR2参与角膜免疫反应的研究较少,角膜上皮细胞TLR2表达影响角膜内DCs成熟的实验研究未见报道,因此设计本实验进行初步研究探讨。第一部分肽聚糖诱导角膜上皮细胞TLR2表达的实验研究目的研究不同浓度肽聚糖刺激不同时间对角膜上皮细胞TLR2表达的影响。方法原代培养小鼠角膜上皮细胞,随机分为对照组和肽聚糖组。肽聚糖组按照刺激浓度分为10ug/ml组、30ug/ml组、80ug/ml组(作用时间均为12h);按照刺激时间分为12h组、24h组、36h组(作用浓度均为30ug/ml),应用RT-PCR检测Myd88mRNA相对表达量;流式细胞术检测各组TLR2荧光阳性细胞百分比。结果RT-PCR 结果证实:与对照组(1.00±0.14、1.00±0.01)相比,10ug/ml 组(4.35±0.46、3.53±0.5)、30ug/ml 组(8.06±0.72、5.31±0.34)、80ug/ml 组(2.93±0.46、2.23±0.04)的TLR2、myd88mRNA表达增加,差异有统计学意义(均为P<0.05);与对照组(1.00±0.14、1.00±0.01)相比,12h 组(2.93±0.46、2.23±0.5)、24h组(2.08±0.72、1.71±0.34)、36h 组(1.66±0.46、1.49±0.04)TLR2、Myd88mRNA表达量明显升高,差异有统计学意义(均为P<0.05)。流式细胞术蛋白检测结果与RT-PCR相一致。结论肽聚糖可以刺激小鼠角膜上皮细胞高表达TLR2、Myd88,提示角膜上皮细胞可能通过TLR2-Myd88信号通路调控角膜免疫应答。第二部分角膜上皮细胞TLR2表达调控DC成熟的实验研究目的探索角膜上皮细胞TLR2表达对DCs成熟的影响,以及调控角膜固有免疫反应作用机制。方法采用酶消法制备小鼠角膜上皮细胞,分为对照组(野生鼠角膜上皮细胞)、刺激组(肽聚糖刺激诱导野生鼠角膜上皮细胞TLR2表达增加)、敲除组(TLR2基因敲除鼠角膜上皮细胞)。收集各组角膜上皮细胞调整密度为2×106/孔,与小鼠骨髓源未成熟DC(Immature dendritic cell,imDCs)按照2:1的比例共同培养24h,收集各组悬浮状态的DCs,分别进行:(1)RT-PCR检测细胞CD80、CD86、MHCⅡ的mRNA相对表达量;(2)流式细胞仪检测细胞CD80、CD86、MHCⅡ蛋白表达量;(3)DCs与小鼠淋巴结T细胞共同培养72h,CCK-8检测同种异体混合淋巴反应中T细胞增殖情况。结果RT-PCR结果证实:刺激组CD80(4.23±0.21)、CD86(4.40±0.12)、MHCⅡ(11.52±0.54)mRNA相对表达量比对照组明显增加(P=0.02、0.01、0.03);流式细胞术结果显示,刺激组CD80(0.50±0.03)、CD86(0.25±0.04)、MHCⅡ(4.52±0.34)蛋白表达量比对照组明显增加(P=0.04、0.01、0.02);CCK-8检测结果证实:刺激组的T细胞增值率(45.4±0.09%)比对照组(25.4±0.09%)明显增加(P=0.01)。结论小鼠角膜上皮细胞高表达TLR2可以促进DCs成熟,提示角膜上皮细胞TLR2可能通过诱导DCs活化加速角膜固有免疫反应。