本文研究目的： 1.设计和合成靶向作用于人分子标靶MT功能基因的核酶序列片段，并构建其重组真核表达载体； 2.应用MT基因核酶重组质粒暂时性转染人鼻咽癌(NPC)细胞，介导有效的靶向基因表达抑制；此外，构建人MTcDNA重组真核表达载体，建立MT高表达细胞模型，为应用于毒理学和肿瘤化学干预中细胞毒性的研究提供方法和工具； 3.评价细胞内MT表达干预(抑制或诱导高表达)对NPC细胞转归的影响，了解细胞内MT表达与可诱导性细胞毒性和化学干预作用敏感性的关系。 研究方法： 1.靶向作用于人金属硫蛋白(MT)基因锤头核酶的设计和合成1.1靶向人MT基因锤头核酶的设计和分析：选择MT家族中MT1B和MT2A功能基因作为靶标，分别设计靶向特异性核酶序列MT-Rz及其串联核酶序列；同时设计突变体无活性核酶MT-mRz作为对照。利用Mfold在线分析软件进行二级结构预测。 1.2靶向人MT基因锤头核酶的合成：分别设计和合成靶向MT1B和MT2A功能基因核酶和突变核酶的特异性引物，PCR反应合成相应的核酶双链片段及其串联核酶片段。 2.靶向MT基因核酶、cDNA重组T载体和pCI-neo真核表达载体的构建。 2.1MT基因锤头核酶重组T载体的构建：目的核酶片段与T载体连接后，转化超感受态细胞，筛选阳性克隆扩增、抽提质粒。通过PCR扩增、限制性酶切和双向测序，鉴定目的核酶序列片段T载体克隆是否成功。 2.2靶向MT基因核酶pCI-neo重组真核表达载体的构建：将成功构建的重组T载体质粒双酶切，定向克隆构建目的核酶序列片段的pCI-neo重组真核表达载体，并测序确证。 2.3MT功能基因cDNA重组T载体和pCI-neo真核表达载体构建：抽提人鼻咽癌CNE1细胞总RNA，经RT-PCR获取人MT-1B和MT-2A功能基因cDNA片段，T克隆构建重组T载体并测序分析确证。将酶切获得的目的cDNA片段定向克隆，构建成MT功能基因cDNA的pCI-neo重组真核表达载体，并测序确证。 3.鼻咽癌细胞内MT基因表达的靶向干预及其对细胞毒性和转归的影响。 3.1靶向MT基因核酶重组真核表达质粒转染对NPC细胞内MT表达和细胞功能活性的影响。 3.2靶向MT基因cDNA重组真核表达质粒转染介导NPC细胞内MT高表达及其与细胞功能活性和转归的关系。 3.3靶向MT基因核酶重组真核表达质粒转染对NPC细胞化学干预作用敏感性的影响。 实验结果： 1.靶向作用于人金属硫蛋白(MT)基因锤头核酶的设计和合成。 1.1靶向MT功能基因锤头核酶的设计分别确定MT1B和MT2AmRNA中+145～+147的GTC和ATC为潜在Rz靶切割位点。以5，-CUGAUGAGUCCGUGAGGACGAA-3的22nt为目的Rz核心序列。以靶切割位点两侧翼+148～+157的10nt和+137～+144的8nt序列分别为目的Rz的茎干I和III。设计71nt的MT1B-Rz序列、72nt的MT2A-Rz序列和133nt的MT1B2A-Rz串联核酶序列。同时设计核心序列中3G→A和7A→G突变的MT1B-mRz、MT2A-mRz和MT1B2A-mRz序列作为无活性核酶对照。Mfold软件二级结构预测分析结果表明上述序列片段可形成锤头样结构，其两侧翼序列未见特定二级结构形成，能满足与目的MT基因mRNA序列中互补片段特异件结合的要求。 1.2靶向MT基因锤头核酶的合成PCR产物凝胶电泳结果可见，MT1B-Rz、MT1B-mRz和MT2A-Rz、MT2A-mRz形成的特异性条带与预计的71bp和72bp产物相符。MT1B2A-Rz、MT1B2A-mRz形成的条带与预计的133bp串联核酶产物相符。 2.靶向MT基因锤头核酶、cDNA重组T载体和pCI-neo真核表达载体的构建。 2.1MT基因锤头核酶重组T载体的构建目的核酶片段T克隆在选择性平板上形成生长克隆。T7/SP6鉴定结果显示含插入子的克隆形成的特异性条带，与预计的246bp或247bp产物片段长度相符。阳性重组质粒DNA的T7/SP6双向测序结果可见正向或反向插入的目的片段序列，碱基序列与设计的各种核酶序列完全一致。证实设计和合成了目的核酶双链片段、并成功构建核酶重组T载体，分别命名为pT-MT-Rz或pT-MT-mRz。 2.2靶向MT基因核酶pCI-neo真核表达重组载体的构建重组T载体质粒的特异性双酶切产物定向克隆入pCI-neo真核细胞表达载体，挑取转化生长的单克隆，T7EEV/T3PCR鉴定，阳性克隆扩增的特异性条带，与预计的161bp或157bp产物片段长度相符。重组质粒DNA经pCIneo-F1、pCIneo-R1双向测序结果可见，插入子片段的碱基与设计的各种目的核酶序列完全一致。证实成功构建MT基因目的核酶pCIneo重组表达载体，分别命名为pCI-MTRz或pCI-MTmRz。 2.3MT功能基因cDNA重组T载体和pCI-neo真核表达载体构建RT-PCR扩增结果，获得308bp和326bp的MT-1B和MT-2A基因cDNA目的片段。转化生长形成的T克隆，经T7/SP6PCR和重组质粒DNA双向测序鉴定后，证实插入片段与相应的人MT基因cDNA序列完全一致，分别命名为pT-MT1BcDNA和pT-MT2AcDNA。 双酶切获得特异性目的cDNA片段，定向克隆pCI-neo真核细胞表达载体，阳性克隆经T7EEV/T3PCR鉴定和pCI-IDF1、pCI-IDR1双向测序，证实成功构建目的cDNA序列pCIneo重组真核表达载体，分别命名为pCI-MT1BcDNA和pCI-MT2AcDNA。 3.鼻咽癌细胞内MT基因表达的靶向干预及其对细胞毒性和转归的影响。 3.1pCI-MTRz质粒转染NPC细胞对MT表达及细胞功能活性和转归的影响细胞形态学观察结果可见，正常对照组和pCIneo转染组细胞形态正常、贴壁生长，细胞边界清晰、胞浆丰富、胞核大而凸起；pCI-MT1BRz、pCI-MT2ARz和pCI-MT1B2ARz转染组细胞，均可见不同程度的细胞数量减少，胞浆减少、形态变圆、膜皱缩、体积变小、细胞失贴壁(detachment)而悬浮。 细胞内MTmRNA水平的RT-PCR检测结果，与pCIneo组(MT/G3PDH积分光密度比值为100％，以下表示相同)比较，CNE1细胞中pCI-MT1BRz和pCI-MT1B2ARz组MT1BmRNA水平降低(分别为35.6％和30.8％)；pCI-MT2ARz和pCI-MT1B2ARz组MT2AmRNA水平也降低(分别为60.4％和78.5％)。相似地，SUNE细胞pCI-MT1BRz和pCI-MT1B2ARz组MT1BmRNA水平降低(分别为56.2％和35.7％)；pCI-MT2ARz和pCI-MT1B2ARz组MT2AmRNA水平也降低(分别为45.1％和38.5％)。 3.2pCI-MTcDNA转染NPC细胞介导MT高表达及其与细胞功能活性和转归的关系转染细胞内MT表达分析结果可见，与正常对照和pCIneo组比较，MT1B和MT2AmRNA水平在CNE1细胞(分别为250.8％和164.5％)和SUNE细胞(分别为183.7％和135.9％)均表现为增高；细胞内MT蛋白表达分布，在CNE1和SUNE呈明显泛化、胞质内阳性棕褐色颗粒增多，表达程度呈强阳性深染。提示NPC细胞内MT诱导高表达模型的建立。 3.3pCI-MTRz转染对NPC细胞化学干预作用敏感性的影响与pCI-MTRz单独转染组比较，转染细胞给予化学干预因子cDDP或TNF-α处理后，细胞增殖功能活性显著降低、抑制率明显增高；出现典型的凋亡核形态，核深染、核固缩、核碎裂等形态变化增加；同时细胞内MT蛋白表达降低。提示核酶介导的细胞内MT表达抑制与其增强cDDP或TNF-α诱导的细胞功能抑制和细胞诱导性凋亡的结果相符。 研究结论 1.成功构建靶向人MT-1B和MT-24基因的锤头核酶(Rz)及其相应突变体核酶(mRz)的重组T载体质粒及pCIneo目的核酶重组真核表达质粒(pC1-MT-Rzs)，在方法学上为MT生物学作用的探讨提供研究工具。 2.目的核酶重组真核表达质粒转染人鼻咽癌(NPC)细胞，可靶向特异性地抑制目的基因mRNA及其蛋白表达水平，并影响细胞功能活性和转归。提示MT核酶对目的基因表达的靶向敲低作用具有生物学效应，为阐释MT在致癌过程中的作用提供依据。 3.MT核酶重组真核表达质粒可介导顺铂和TNF-o作用细胞内的MT表达抑制，增强顺铂或TNF-α诱导的细胞增殖抑制和诱导性凋亡。提示靶向MT基因表达抑制可提高鼻咽癌细胞对化学干预因子毒性作用的敏感性。 4.通过构建人MT-1B和MT-2A基因cDNA序列的重组真核表达质粒(pCI-MTcDNA)，成功地应用于转染NPC细胞建立了细胞内MT高表达模型，且未见诱导细胞毒性，为进一步开展MT介导的细胞毒性机制研究提供基础。