【摘 要】
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药源性骨质疏松是目前常见的骨骼疾病,是由于长期、大量使用影响骨代谢的药物而导致的骨质疏松。目前已有研究证实了部分药源性骨质疏松的机制,但未有研究者探讨药源性骨质疏松的个体差异方面,人群基因易感性尚未体现,寻找药源性骨质疏松的易感基因对原发疾病和药源性骨质疏松的防治均具有重要临床意义。本课题通过对基因芯片进行生物信息学分析,筛选与药源性骨质疏松相关的核心基因,并建立斑马鱼模型进行验证,研究患者用药后
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药源性骨质疏松是目前常见的骨骼疾病,是由于长期、大量使用影响骨代谢的药物而导致的骨质疏松。目前已有研究证实了部分药源性骨质疏松的机制,但未有研究者探讨药源性骨质疏松的个体差异方面,人群基因易感性尚未体现,寻找药源性骨质疏松的易感基因对原发疾病和药源性骨质疏松的防治均具有重要临床意义。本课题通过对基因芯片进行生物信息学分析,筛选与药源性骨质疏松相关的核心基因,并建立斑马鱼模型进行验证,研究患者用药后骨质疏松的易感性与基因亚型的关系。目的:旨在基因层面上筛选出药源性骨质疏松的易感人群,为减少药源性骨质疏松的发生作理论基础。方法:1、利用GEO基因数据库筛选正常人和骨质疏松相关核心基因,应用计算机工具寻找差异基因,利用stitch工具分析每种易导致骨质疏松药物的作用通路,与差异基因做交集,按药物种类挑选出易感基因。2、选择每类药物中最常用的一种,选取野生AB型斑马鱼,从第4dpf开始给药,采取暴露给药的方式,培养直到第9dpf,使用0.2%calcein溶液避光染色,使用正置荧光显微镜观察第3-7节脊椎骨,并拍照记录统计数据。3、利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建基因突变斑马鱼胚胎,给予不同种类药物,观察其用药后发生骨质疏松程度,与正常斑马鱼进行比较,观察其幼鱼体态表型的变化和骨骼钙化程度。结果:1、在GEO数据库下载基因芯片GSE35956,包括5个来自骨质疏松症患者和5个正常人群的人间充质干细胞（MSC）基因芯片。调用R语言的limma包寻找差异基因共9292个。在stitch网站查询各类药物的10个主要作用通路,与差异基因做交集,得到每类药物的候选易感基因。2、选择地塞米松、罗格列酮、华法林、雷贝拉唑、丙戊酸钠作为代表药物进行造模。地塞米松组25μM浓度组斑马鱼脊椎骨荧光面积与阴性对照组相比有明显差异（P＜0.1）。华法林组200μM和400μM两个浓度都成功构建（P＜0.1）;罗格列酮的低浓度组骨质疏松不明显,高浓度组死亡率高;雷贝拉唑组和丙戊酸钠组的饱和浓度组与对照组相比均无明显差异,故舍弃。3、查阅资料后最终筛选出差异基因:地塞米松组为CDK1和PER2,华法林组为GGCX和NQO1。使用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建出CDK1基因表达缺失斑马鱼模型,使用地塞米松给药后与正常斑马鱼相比,体型表态发生了明显的弯曲畸形,钙黄绿素染色发现几乎没有骨骼生长钙化的状态。结论:CDK1基因对骨骼发育有明显的影响,可能是糖皮质激素性骨质疏松的一个重要基因,为今后的精准医学和个体化给药提供了参考依据。综上所述,本课题通过生物信息学与斑马鱼实验相结合的新策略,筛选出一个可能与药源性骨质疏松有关的易感基因CDK1,该基因与药源性骨质疏松的关系在以往研究中很少报道,我们首次证明了它会影响斑马鱼骨质疏松的发生。但若想明确CDK1与此疾病的关系以及相关机制的确认,还需要未来通过基因组学及细胞分子学等方法进一步研究。
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