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转移性乳腺癌严重影响女性生命健康。基于细胞因子白介素-12（IL-12）的免疫治疗被认为是抑制乳腺癌生长和转移的有效方式之一。但用药后严重的不良反应和肿瘤免疫抑制微环境下有限的免疫应答限制了其临床应用。一线化疗药物阿霉素（DOX）在抑制肿瘤细胞增殖和诱导其凋亡的同时,还能引起肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡并中和免疫抑制微环境。因此,DOX与IL-12联合具有化疗-免疫协同抗肿瘤作用,是治疗转移性乳腺癌的一种可行策略。为了进一步提高DOX和IL-12联合抗肿瘤的效果并降低IL-12的副作用,本课题设计了一种肿瘤微环境电荷翻转的聚二甲双胍（PMet）/巯基化透明质酸（HA-SH）纳米系统,联合递送DOX和编码IL-12基因的质粒（pIL-12）,用于化疗-基因联合治疗转移性乳腺癌。其中,阳离子聚合物PMet可自组装成胶束物理包载DOX和静电复合pIL-12,形成pIL-12/DOX-PMet胶束。另外,将透明质酸酶（HAase）敏感的HA-SH共组装至pIL-12/DOX-PMet外层,构成HA/pIL-12/DOX-PMet共载药胶束。该纳米胶束具有肿瘤微环境透明质酸酶响应特性,可实现电荷翻转,完成药物的共释放,发挥化疗免疫协同作用,抑制乳腺癌的生长和转移。具体内容如下:采用可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合法合成具有胶束自组装特性的阳离子聚合物PMet。1H NMR技术鉴定聚合物的化学结构,PMet中二甲双胍的含量为30.4%。采用溶剂挥发法并结合静电复合作用制备了pIL-12/DOX-PMet胶束,结果显示pIL-12/DOX-PMet对DOX具有较高的包封率和载药量。同时,琼脂糖凝胶电泳实验结果表明阳离子聚合物PMet对pIL-12具有较高的凝聚能力。采用化学键合的方法合成HA-SH,使其通过静电复合与硫醇化学交联作用共组装在pIL-12/DOX-PMet表面,形成HA/pIL-12/DOX-PMet共载药胶束,以屏蔽pIL-12/DOX-PMet较高的正电荷而增加其在体内的稳定性。通过响应透明质酸酶,HA/pIL-12/DOX-PMet共载药胶束可发生电荷翻转,重新暴露PMet的阳离子基团,促进pIL-12与DOX的释放。采用MTT法考察HA/pIL-12/DOX-PMet对4T1乳腺癌细胞的毒性作用,结果表明该共载药胶束可有效抑制肿瘤细胞增殖。凋亡实验结果表明HA/pIL-12/DOX-PMet具有更高的促凋亡效果。采用流式细胞术分析DOX和FITC-pIL-12通过HA/PMet胶束共递送至4T1细胞的效果,确保两药递送至同一肿瘤细胞中发挥抗肿瘤疗效。同时,透明质酸的竞争性抑制实验结果表明HA/pIL-12/DOX-PMet可通过CD44受体介导的内吞作用摄取入胞。进一步评价了HA/PMet纳米载体系统在4T1细胞中的转染效率。结果表明HA/PMet载体系统具有优异的p EGFP和pIL-12传递和转染性能,并确定载体与基因的最佳氮/磷（N/P）比为20/1,以该比例进行了以下体内研究。体内药动学结果显示,HA/pIL-12/DOX-PMet可明显提高DOX在血浆中的浓度,实现长循环。建立4T1乳腺癌小鼠模型,通过UPLC-FIR测定HA/pIL-12/DOX-PMet在肿瘤小鼠各组织中的分布情况,结果显示共载药胶束明显提高了DOX在肿瘤组织中的含量,表明HA/pIL-12/DOX-PMet可以有效靶向蓄积至肿瘤组织从而降低游离药物的毒副作用。另一方面,体内基因转染结果表明,HA/PMet载体具有良好的p EGFP和pIL-12转染效率。因此,对于DOX与pIL-12介导的联合治疗而言,HA/PMet胶束是一种有效的DOX递送和IL-12转染载体。建立4T1乳腺癌小鼠模型,考察HA/pIL-12/DOX-PMet在肿瘤小鼠体内的抗肿瘤及抑制肺转移效果。结果显示,HA/pIL-12/DOX-PMet共载药胶束具有最佳的抑制小鼠肿瘤增长的作用,给予该制剂的肿瘤小鼠存活时间最长,肿瘤组织的H&E和TUNEL实验结果更进一步证明共载DOX和pIL-12的胶束能显著诱导肿瘤细胞坏死与凋亡。小鼠体重和组织器官H&E染色结果表明,HA/pIL-12/DOX-PMet共载药胶束可显著降低DOX对心脏和肾脏的毒性并且具有良好的体内生物相容性。除此之外,给予HA/pIL-12/DOX-PMet治疗的小鼠具有最高的抑制肿瘤肺转移活性,肺内肿瘤结节数量最少。上述实验结果表明,通过靶向共递送DOX和pIL-12显著提高了两药协同抗肿瘤的功效,证明了纳米给药系统的联用药物共包载及体内共递送对提高联合治疗功效具有重要意义。为进一步探究HA/pIL-12/DOX-PMet共载药胶束介导的化疗免疫分子机制,采用流式细胞术检测了肿瘤组织中的T淋巴细胞（CD4、CD8）、NK细胞和免疫负性调节细胞Treg的增殖水平,以及促肿瘤M2-型肿瘤相关巨噬细胞向抗肿瘤M1-型肿瘤相关巨噬细胞转化的水平,并采用ELISA试剂盒检测了细胞因子IL-12、IFN-γ和TNF-α的分泌水平。结果显示HA/pIL-12/DOX-PMet治疗后,小鼠肿瘤组织中CD4+T、CD8+T细胞、NK细胞增多,调节性T细胞减少,IL-12、IFN-γ和TNF-α等促免疫细胞因子含量提升。此外,HA/pIL-12/DOX-PMet在减少M2-型巨噬细胞的同时很大程度上增加了M1-型巨噬细胞的数量。采用免疫荧光染色进一步考察CD8+T细胞和NK细胞在肿瘤组织中的浸润情况,结果显示,HA/pIL-12/DOX-PMet治疗后肿瘤组织中CD8+T细胞和NK细胞的荧光信号最强。以上结果表明,HA/pIL-12/DOX-PMet共载药胶束可促进肿瘤微环境中相关免疫效应细胞的增殖及细胞因子的分泌,从而产生最佳的化疗免疫协同抗肿瘤作用。综上所述,肿瘤微环境电荷翻转的HA/PMet纳米载体系统可有效实现DOX和pIL-12的体内共递送,为转移性乳腺癌的化疗-基因联合治疗提供了一种较好的方案。