次声是频率为10-4～20 Hz的弹性机械纵波,其频率与机体组织器官的共振频率相近,可直接引起机体组织及脏器的共振,产生一系列的生物学效应,造成一定程度的损伤。以往研究表明,次声作用后可引起脑组织谷氨酸过度释放或重吸收障碍,导致脑组织中谷氨酸蓄积,诱发神经元的一系列病理损害。细胞外没有使谷氨酸代谢失活的酶,而使谷氨酸在神经系统灭活的唯一途径是通过神经细胞的再摄取和吸收,其中起主要作用的是谷氨酸转运蛋白,因此谷氨酸转运蛋白的表达变化在神经元损伤机制中起着重要作用。谷氨酸转运蛋白也称兴奋性氨基酸转运蛋白(Excitatory amino acid transporter,EAAT),主要存在于神经细胞和神经胶质细胞质膜上。EAAT参与谷氨酸的重吸收,研究其在次声作用后的mRNA表达变化及其作用,可为次声脑损伤的防治提供一定的理论基础。实验一大鼠次声脑损伤模型的建立目的:建立一种可靠的、简便易行的大鼠次声脑损伤模型,为进一步深入进行神经系统损伤的病理学和分子生物学研究奠定良好的基础。方法:清洁级成年雄性SD大鼠80只由第四军医大学实验动物中心提供[许可证号:SCXK(军)2004-005],体质量(280±1 5)g,随机分为正常对照组、次声作用1、7及l4次组,每组20只。采用本校与航天工业部41所其同研制的次声压力仓,实验用8Hz 130dB的次声。除对照组每日在次声压力仓内滞留2 h而无次声作用外,其余各组均按分组次数每日在次声压力仓内全身作用2 h。以神经系统疾病严重程度评分(neurological severity score,NSS)及病理学方法观察损伤结果。结果:在各实验组随机抽取大鼠10只,分别在完成次声作用后1h、24h、48h进行NSS评分。统计学分析表明,1次组与对照组无显著性差异,7次和14次组,大鼠NSS评分则显著高于对照组(p<0.01)。14次组,大鼠在损伤后1h高于7次在相应时刻的NSS评分(p<0.05)。在次声作用后1h光镜下观察,1次组,未发现脑皮质神经元出现明显的病理学损伤,细胞结构完整。7次和14次组,大鼠皮质部分神经元出现损伤改变。包括:核浓缩、胞浆深染、细胞结构不清,损伤神经元广泛分布于皮质,可见损伤细胞和小血管周围水肿。次声1次组与对照组比较,损伤神经元无显著差异。次声7次、14次组损伤神经元明显增加。电镜标本在透射电镜下观察。次声1次组,透射电镜下可以观察到皮质结构中的微血管周围轻度水肿。部分神经元低染,细胞膜轻度改变,内质网轻度扩张,高尔基氏体的基质轻度融合。线粒体数量基本正常,形态上轻度扩张。轴索内少量线粒体出现空泡样改变,髓壳形态基本正常。次声7次组,透射电镜下可以观察到皮质结构中的微血管周围轻度水肿、渗出明显。神经元细胞核形态不规则,核膜变形,部分神经元出现染色质边集,核固缩现象。胞浆中有大量微丝形成,并出现少量的脂褐素。细胞器数目明显减少,线粒体肿胀,嵴断裂、减少、消失、空泡样变。神经元轴突髓壳崩解,表现为髓壳样改变。14次与7次组比较,上述神经元的损伤征象范围较广,程度加重,固缩坏死神经元的数量增多。结论:应用该模型次声对大鼠脑有确切损伤效果,模型具有良好的可重复性、稳定性及易操作性,为今后实验打下良好基础。实验二大鼠次声脑损伤后谷氨酸转运蛋白(EAAT)mRNA的变化目的:通过实验,了解大鼠次声脑损伤损伤后EAATmRNA的表达规律及其对神经元损伤的意义,以及各亚型EAAT在此类损伤中发挥的异同作用。方法:清洁级成年雄性SD大鼠80只,体质量(280±1 5)g,分为正常对照组、次声作用1、7及l4次组,每组20只,实验用8Hz 130dB次声制备脑损伤模型。设计EAAT各亚型引物,取正常大鼠1只,通过脑组织匀浆提取总RNA、反转录、转化、质粒酶切线性化、DNA回收、体外转录等分子生物学方法制备各亚型正义及反义探针。随机抽取各实验组动物各10只,脑组织冰冻切片,进行RNA探针原位杂交实验,对脑片进行灰度分析。取各实验组动物各10只,取大脑海马组织,匀浆后提取总RNA,采用各亚型引物进行荧光实时定量PCR法检测,根据Ct值与起始模板数的对数值成反比线性关系确定各组实验动物皮质组织mRNA表达量,明确其变化规律。结果:与同时间对照组比较,8 Hz 130 dB的次声作用2h后, EAAT1mRNA、EAAT2mRNA表达水平即发生了上调,连续7天作用后,上调明显, 14天组则略有恢复,但表达水平仍高于对照组。EAAT3mRNA表达水平在次声作用前后变化无统计学差异。结论:8 Hz 130 dB的次声脑损伤后,EAAT1、EAAT2mRNA表达增加,EAAT1、EAAT2合成加速,有利于机体清除蓄积的谷氨酸,防止其神经毒性损伤作用,上调EAAT1、EAAT2和促进其mRNA表达可能对次声脑损伤后脑组织有保护作用。