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【目的】
2型糖尿病导致骨质疏松症(DOP)和脆性骨折发病率越来越高,临床防治研究得到重视。DOP的原因复杂,经典抗骨质疏松药物疗效不显著。染料木黄酮(genistein,简写为GEN)是植物多酚类化合物,具有广泛的药理作用,可调节机体的脂代谢、骨代谢和保护心脑血管。本研究第一部分采用db/db小鼠2型糖尿病(T2DM)诱发骨质疏松模型,研究GEN对小鼠骨代谢的保护作用及其作用机制;第二部分研究GEN对体外培养人成骨样MG63细胞(MG)在D-葡萄糖复制的高糖(HG)环境下的作用及其对MG细胞OPG/RANKL/RANK通路以及骨形成相关蛋白OCN,RUNX2等蛋白的影响。为GEN多靶点防治DOP新用途及其机制提供新的实验依据。
【方法】
1.采用db/db小鼠研究GEN对DOP的保护作用
选择24只6周龄的C57BL/6-DB雄性小鼠,以下简称db/db小鼠,作为2型糖尿病小鼠模型。按照完全随机模式,将入组db/db小鼠随机平均分配至未干预组(db/db);染料木黄酮处理组(db/db+gen);胰岛素处理组(db/db+ins);另选择8只6周龄的m/m组雄性小鼠作对照组(m/m),共4组,每组8只。8周龄时给予db/db+gen组GEN50g/kg/day,其余三组正常饮食;给予db/db+ins组胰岛素处理,皮下注射甘精胰岛素25nmol/kg/day,其余三组皮下注射等体积生理盐水。期间严格按照既定给药方式进行给药。每周检测各组体重,进食量,空腹血糖值,每四周检测糖化血红蛋白(HbAlc)变化情况。24周龄时,禁食24h,按动物伦理学规定处死动物,小鼠称重后,用2%戊巴比妥钠(10ul/g)腹腔注射,分离小鼠双侧股骨进行骨密度(BMD)、骨生物力学、Micro-CT、病理切片、提取小鼠胫骨蛋白进行蛋白免疫印迹(Western Blot, WB)检测。
2.在细胞水平研究GEN在HG环境下对骨形成的影响
选取人成骨样MG63细胞株(本文简写MG),用D-葡萄糖和GEN处理细胞。用MTT法检测细胞的增殖能力,碱性磷酸酶(ALP)染色法和茜素红矿化染色法检测体外成骨矿化能力,以观察HG环境下GEN的干预对MG细胞的增殖作用以及成骨矿化的影响。同时,用细胞免疫荧光(cell immunofluorescence, ICC)法以及WB法检测HG环境对MG细胞中OPG/RANKL/RANK信号通路中相关蛋白分子,骨胶原蛋白以及骨形成相关蛋白OCN,RUNX2的表达水平的影响及GEN的干预作用。初步探讨研究HG环境和GEN对MG细胞增殖和骨形成功能的影响以及其作用机制。
【结果】
1.GEN对db/db小鼠骨代谢的影响
1.1小鼠体重的变化
在16周的给药处理期间,与m/m组相比,db/db组,db/db+gen组,db/db+ins三组小鼠的体重都明显增加(P<0.05);与db/db组相比,db/db+gen组小鼠体重明显降低(P<0.05),db/db+ins组小鼠体重无明显变化;与db/db+ins组相比,db/db+gen组小鼠体重明显降低(P<0.05)。
1.2小鼠血糖以及HbAlc值的变化
在16周的给药处理期间,与m/m组相比,db/db组,db/db+gen组,db/db+ins三组小鼠的血糖以及HbAlc值都明显增加(P<0.05);与db/db组相比,db/db+gen组,db/db+ins组小鼠的血糖以及HbAlc值都明显降低(P<0.05);与db/db+ins组相比,db/db+gen组小鼠的血糖以及HbAlc值无明显变化。
1.3小鼠骨骼重量的变化
实验16周后取材后的骨重结果显示:与m/m组相比,db/db组小鼠骨重明显降低(P<0.05),db/db+gen组,db/db+ins组小鼠骨重也有降低趋势,但差异无统计学意义(P>0.05);与db/db组相比,db/db+gen组,db/db+ins二组小鼠骨重明显增加(P<0.05);与db/db+ins组相比,db/db+gen组小鼠骨重无明显变化。
1.4小鼠左侧股骨骨生物力学性能的变化
三点弯曲试验结果显示,与m/m组相比,db/db组,db/db+ins组小鼠的最大载荷,弹性载荷,断裂载荷以及刚性系数均明显减少(P<0.05),db/db+gen组小鼠的弹性载荷也明显减小(P<0.05),最大载荷,断裂载荷以及刚性系数也有减小的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05);与db/db小鼠相比,db/db+gen组小鼠股骨的最大载荷,弹性载荷,断裂载荷以及刚性系数均明显大于db/db组小鼠(P<0.05);db/db+ins组小鼠的刚性系数也明显大于db/db组小鼠(P<0.05),其他三项也有增加趋势,但差异均无统计学意义(P>0.05);与db/db+ins组相比,db/db+gen组的最大载荷,断裂载荷以及刚性系数均明显增加(P<0.05),弹性系数有增加的趋势,差异无统计学意义(P>0.05)。
1.5小鼠右侧股骨micro-CT检测的骨微结构的变化
股骨远端松质骨二维、三维形态计量学的结果显示,与m/m组相比,db/db组以及db/db+ins组小鼠的骨小梁面积百分数(BS/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨相对体积比(BV/TV)均明显减少(P<0.05),骨分离度(Tb.Sp)增加(P<0.05),db/db+gen组参数无明显变化;与db/db组相比,db/db+gen组以及db/db+ins组小鼠BS/TV、Tb.N、Tb.Th、BV/TV明显增加(P<0.05),Tb.Sp明显减小(P<0.05)。与db/db+ins组相比,db/db+gen组小鼠的BS/TV、Tb.N、Tb.Th、BV/TV都明显增加(P<0.05),Tb.Sp明显减小(P<0.05)。
与m/m组相比,db/db组,db/db+ins组小鼠BMD都明显减小(P<0.05),db/db+gen组BMD无明显变化;与db/db组相比,db/db+gen组,db/db+ins组小鼠BMD较db/db组明显升高(P<0.05),与db/db+ins组相比,db/db+gen组BMD值有增加趋势,但差异无统计学意义(P<0.05)。
与m/m组相比,db/db组小鼠股骨中段的Ct.Ar明显下降(P<0.05),%Ct.Ar值与%Ma.Ar值无明显变化;与db/db组相比,db/db+gen组小鼠的Ct.Ar明显增加(P<0.05),%Ct.Ar值也有增加,%Ma.Ar值有减小趋势,但是差异无统计学意义(P>0.05),db/db+ins组Ct.Ar明显增加(P<0.05),%Ct.Ar值与%Ma.Ar值无明显变化;与db/db+ins相比,db/db+gen组小鼠的Ct.Ar,%Ct.Ar值有增加的趋势,%Ma.Ar值有减小趋势,但差异均无统计学意义(P>0.05)。
1.6小鼠骨量变化
小鼠右侧侧股骨上段病理学切片结果显示:与m/m组相比,db/db组,db/db+ins组小鼠骨小梁分布稀疏,骨量明显减少(P<0.05),db/db+gen组骨量无明显变化。与db/db组相比,db/db+gen组小鼠骨小梁分布较为密集,骨量明显增多(P<0.05),db/db+ins组小鼠骨小梁分布以及骨量无明显变化。与db/db+ins组相比,db/db+gen组小鼠骨小梁分布有更加密集的趋势,骨量也明显增多(P<0.05)。
1.7小鼠骨组织WB结果
小鼠胫骨WB结果显示:与m/m组相比,db/db组,db/db+ins组骨中RANKL蛋白表达升高,OPG蛋白表达、OPG/RANKL比率均明显明显减少(P<0.05),db/db+gen组RANKL蛋白表达增加(P<0.05),OPG表达以及以及OPG/RANKL比率无明显变化;与db/db组相比,db/db+gen组骨中RANKL蛋白表达明显降低,OPG表达以及OPG/RANKL比率明显增加(P<0.05),db/db+ins组小鼠骨组织中RANKL表达明显降低(P<0.05),OPG以及OPG/RANKL比率无明显变化;与db/db+ins组相比,db/db+gen组RANKL表达明显降低(P<0.05),OPG表达、OPG/RANKL比率明显增加(P<0.05)。与m/m组相比,db/db组骨中COL1A2蛋白、COL2A1蛋白表达水平明显降低(P<0.05),db/db+gen组,db/db+ins组骨中COL2A1蛋白表达水平明显降低(P<0.05),COL1A2蛋白表达水平无明显变化;与db/db组相比,db/db+gen组骨中COL1A2蛋白、COL2A1蛋白表达水平明显升高(P<0.05),db/db+ins组中表达无明显变化;与db/db+ins组相比,db/db+gen组中COL2A1表达明显增加(P<0.05),COL1A2表达无明显变化。
2.高糖(HG)环境下GEN对MG细胞骨矿化形成的影响
2.1HG环境对MG细胞活力的影响以及GEN的干预作用
MTT结果显示,与CON组相比,D-葡萄糖200μmol/L作用24h即可显著地抑制MG细胞的增殖,浓度为150μmol/L时作用48h和72h可明显抑制MG细胞的增殖(P<0.05),浓度为100μmol/L时作用72h可明显抑制MG细胞的增殖(P<0.05),抑制作用随浓度增强;与HG组相比,GEN浓度为5μmol/l、10μmol/L作用24h时即可明显促进HG环境下MG细胞的增殖(P<0.05),促进作用随着时间增强。20μmol/L浓度组在作用48h、72h时对高糖作用下的MG细胞增殖有明显地促进作用(P<0.05),在24h时有明显地抑制作用(P<0.05)。
2.2HG环境对MG细胞矿化能力的影响以及GEN的干预作用
碱性磷酸酶(ALP)染色以及茜素红染色结果显示,与CON组相比,葡萄糖浓度在100μmol/l及以上时会明显抑制MG细胞的碱性磷酸酶的生成,也会相应的抑制成骨矿化。GEN干预后,浓度为5μmol/l、10μmol/l、20μmol/l的GEN对高糖抑制的MG细胞ALP活性以及矿化作用都有非常好的促进作用,而浓度为10μmol/l的干预组效果最佳。
2.3HG环境对MG细胞骨胶原蛋白以及骨形成相关蛋白OCN、RUNX2表达水平的影响以及GEN的干预作用
ICC结果显示,与CON组相比,HG环境下的OCN、RUNX2、COL1A2以及COL-III蛋白荧光强度明显降低。加入5μmol/l、10μmol/l,20μmol/l的GEN干预后,OCN、RUNX2、COL1A2以及COL-III蛋白荧光强度均有不同程度的增高,其中HG+10GEN浓度组的荧光强度增强效果最为显著。
2.4HG环境对MG细胞OPG/RANKL/RANK信号通路相关蛋白表达水平的影响以及GEN的干预作用
WB结果显示:与CON组相比,HG组细胞中OPG蛋白表达以及OPG/RANKL比率明显降低(P<0.05),RANKL蛋白表达水平显著增高(P<0.05);与HG组相比,GEN处理组促进HG环境下MG细胞中OPG蛋白的表达(P<0.05),降低RANKL蛋白的表达水平(P<0.05),上调了OPG/RANKL的比率(P<0.05)。GEN对HG环境引起的OPG蛋白表达降低,OPG/RANKL比率降低,RANKL蛋白表达水平增高有逆转趋势。
【结论】
1.db/db小鼠的体重、血糖和HbAlc均明显增加,伴随骨质减少、骨强度降低,说明db/db小鼠可诱发DOP。
2.给予db/db小鼠GEN饮食干预后,可逆转db/db小鼠血糖升高、HbAlc值增大的情况,改善db/db小鼠的骨骼微环境,增强骨质量,减少骨丢失,抑制骨质疏松的出现。
3.HG环境下会抑制MG细胞的增值以及成骨矿化,给予GEN干预以后,则会抵抗这种抑制作用。
4.GEN可增强骨胶原蛋白以及成骨相关蛋白OCN、RUNX2的表达,同时调节OPG/RANKL/RANK信号通路发挥抑制db/db小鼠骨质疏松的作用。
2型糖尿病导致骨质疏松症(DOP)和脆性骨折发病率越来越高,临床防治研究得到重视。DOP的原因复杂,经典抗骨质疏松药物疗效不显著。染料木黄酮(genistein,简写为GEN)是植物多酚类化合物,具有广泛的药理作用,可调节机体的脂代谢、骨代谢和保护心脑血管。本研究第一部分采用db/db小鼠2型糖尿病(T2DM)诱发骨质疏松模型,研究GEN对小鼠骨代谢的保护作用及其作用机制;第二部分研究GEN对体外培养人成骨样MG63细胞(MG)在D-葡萄糖复制的高糖(HG)环境下的作用及其对MG细胞OPG/RANKL/RANK通路以及骨形成相关蛋白OCN,RUNX2等蛋白的影响。为GEN多靶点防治DOP新用途及其机制提供新的实验依据。
【方法】
1.采用db/db小鼠研究GEN对DOP的保护作用
选择24只6周龄的C57BL/6-DB雄性小鼠,以下简称db/db小鼠,作为2型糖尿病小鼠模型。按照完全随机模式,将入组db/db小鼠随机平均分配至未干预组(db/db);染料木黄酮处理组(db/db+gen);胰岛素处理组(db/db+ins);另选择8只6周龄的m/m组雄性小鼠作对照组(m/m),共4组,每组8只。8周龄时给予db/db+gen组GEN50g/kg/day,其余三组正常饮食;给予db/db+ins组胰岛素处理,皮下注射甘精胰岛素25nmol/kg/day,其余三组皮下注射等体积生理盐水。期间严格按照既定给药方式进行给药。每周检测各组体重,进食量,空腹血糖值,每四周检测糖化血红蛋白(HbAlc)变化情况。24周龄时,禁食24h,按动物伦理学规定处死动物,小鼠称重后,用2%戊巴比妥钠(10ul/g)腹腔注射,分离小鼠双侧股骨进行骨密度(BMD)、骨生物力学、Micro-CT、病理切片、提取小鼠胫骨蛋白进行蛋白免疫印迹(Western Blot, WB)检测。
2.在细胞水平研究GEN在HG环境下对骨形成的影响
选取人成骨样MG63细胞株(本文简写MG),用D-葡萄糖和GEN处理细胞。用MTT法检测细胞的增殖能力,碱性磷酸酶(ALP)染色法和茜素红矿化染色法检测体外成骨矿化能力,以观察HG环境下GEN的干预对MG细胞的增殖作用以及成骨矿化的影响。同时,用细胞免疫荧光(cell immunofluorescence, ICC)法以及WB法检测HG环境对MG细胞中OPG/RANKL/RANK信号通路中相关蛋白分子,骨胶原蛋白以及骨形成相关蛋白OCN,RUNX2的表达水平的影响及GEN的干预作用。初步探讨研究HG环境和GEN对MG细胞增殖和骨形成功能的影响以及其作用机制。
【结果】
1.GEN对db/db小鼠骨代谢的影响
1.1小鼠体重的变化
在16周的给药处理期间,与m/m组相比,db/db组,db/db+gen组,db/db+ins三组小鼠的体重都明显增加(P<0.05);与db/db组相比,db/db+gen组小鼠体重明显降低(P<0.05),db/db+ins组小鼠体重无明显变化;与db/db+ins组相比,db/db+gen组小鼠体重明显降低(P<0.05)。
1.2小鼠血糖以及HbAlc值的变化
在16周的给药处理期间,与m/m组相比,db/db组,db/db+gen组,db/db+ins三组小鼠的血糖以及HbAlc值都明显增加(P<0.05);与db/db组相比,db/db+gen组,db/db+ins组小鼠的血糖以及HbAlc值都明显降低(P<0.05);与db/db+ins组相比,db/db+gen组小鼠的血糖以及HbAlc值无明显变化。
1.3小鼠骨骼重量的变化
实验16周后取材后的骨重结果显示:与m/m组相比,db/db组小鼠骨重明显降低(P<0.05),db/db+gen组,db/db+ins组小鼠骨重也有降低趋势,但差异无统计学意义(P>0.05);与db/db组相比,db/db+gen组,db/db+ins二组小鼠骨重明显增加(P<0.05);与db/db+ins组相比,db/db+gen组小鼠骨重无明显变化。
1.4小鼠左侧股骨骨生物力学性能的变化
三点弯曲试验结果显示,与m/m组相比,db/db组,db/db+ins组小鼠的最大载荷,弹性载荷,断裂载荷以及刚性系数均明显减少(P<0.05),db/db+gen组小鼠的弹性载荷也明显减小(P<0.05),最大载荷,断裂载荷以及刚性系数也有减小的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05);与db/db小鼠相比,db/db+gen组小鼠股骨的最大载荷,弹性载荷,断裂载荷以及刚性系数均明显大于db/db组小鼠(P<0.05);db/db+ins组小鼠的刚性系数也明显大于db/db组小鼠(P<0.05),其他三项也有增加趋势,但差异均无统计学意义(P>0.05);与db/db+ins组相比,db/db+gen组的最大载荷,断裂载荷以及刚性系数均明显增加(P<0.05),弹性系数有增加的趋势,差异无统计学意义(P>0.05)。
1.5小鼠右侧股骨micro-CT检测的骨微结构的变化
股骨远端松质骨二维、三维形态计量学的结果显示,与m/m组相比,db/db组以及db/db+ins组小鼠的骨小梁面积百分数(BS/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨相对体积比(BV/TV)均明显减少(P<0.05),骨分离度(Tb.Sp)增加(P<0.05),db/db+gen组参数无明显变化;与db/db组相比,db/db+gen组以及db/db+ins组小鼠BS/TV、Tb.N、Tb.Th、BV/TV明显增加(P<0.05),Tb.Sp明显减小(P<0.05)。与db/db+ins组相比,db/db+gen组小鼠的BS/TV、Tb.N、Tb.Th、BV/TV都明显增加(P<0.05),Tb.Sp明显减小(P<0.05)。
与m/m组相比,db/db组,db/db+ins组小鼠BMD都明显减小(P<0.05),db/db+gen组BMD无明显变化;与db/db组相比,db/db+gen组,db/db+ins组小鼠BMD较db/db组明显升高(P<0.05),与db/db+ins组相比,db/db+gen组BMD值有增加趋势,但差异无统计学意义(P<0.05)。
与m/m组相比,db/db组小鼠股骨中段的Ct.Ar明显下降(P<0.05),%Ct.Ar值与%Ma.Ar值无明显变化;与db/db组相比,db/db+gen组小鼠的Ct.Ar明显增加(P<0.05),%Ct.Ar值也有增加,%Ma.Ar值有减小趋势,但是差异无统计学意义(P>0.05),db/db+ins组Ct.Ar明显增加(P<0.05),%Ct.Ar值与%Ma.Ar值无明显变化;与db/db+ins相比,db/db+gen组小鼠的Ct.Ar,%Ct.Ar值有增加的趋势,%Ma.Ar值有减小趋势,但差异均无统计学意义(P>0.05)。
1.6小鼠骨量变化
小鼠右侧侧股骨上段病理学切片结果显示:与m/m组相比,db/db组,db/db+ins组小鼠骨小梁分布稀疏,骨量明显减少(P<0.05),db/db+gen组骨量无明显变化。与db/db组相比,db/db+gen组小鼠骨小梁分布较为密集,骨量明显增多(P<0.05),db/db+ins组小鼠骨小梁分布以及骨量无明显变化。与db/db+ins组相比,db/db+gen组小鼠骨小梁分布有更加密集的趋势,骨量也明显增多(P<0.05)。
1.7小鼠骨组织WB结果
小鼠胫骨WB结果显示:与m/m组相比,db/db组,db/db+ins组骨中RANKL蛋白表达升高,OPG蛋白表达、OPG/RANKL比率均明显明显减少(P<0.05),db/db+gen组RANKL蛋白表达增加(P<0.05),OPG表达以及以及OPG/RANKL比率无明显变化;与db/db组相比,db/db+gen组骨中RANKL蛋白表达明显降低,OPG表达以及OPG/RANKL比率明显增加(P<0.05),db/db+ins组小鼠骨组织中RANKL表达明显降低(P<0.05),OPG以及OPG/RANKL比率无明显变化;与db/db+ins组相比,db/db+gen组RANKL表达明显降低(P<0.05),OPG表达、OPG/RANKL比率明显增加(P<0.05)。与m/m组相比,db/db组骨中COL1A2蛋白、COL2A1蛋白表达水平明显降低(P<0.05),db/db+gen组,db/db+ins组骨中COL2A1蛋白表达水平明显降低(P<0.05),COL1A2蛋白表达水平无明显变化;与db/db组相比,db/db+gen组骨中COL1A2蛋白、COL2A1蛋白表达水平明显升高(P<0.05),db/db+ins组中表达无明显变化;与db/db+ins组相比,db/db+gen组中COL2A1表达明显增加(P<0.05),COL1A2表达无明显变化。
2.高糖(HG)环境下GEN对MG细胞骨矿化形成的影响
2.1HG环境对MG细胞活力的影响以及GEN的干预作用
MTT结果显示,与CON组相比,D-葡萄糖200μmol/L作用24h即可显著地抑制MG细胞的增殖,浓度为150μmol/L时作用48h和72h可明显抑制MG细胞的增殖(P<0.05),浓度为100μmol/L时作用72h可明显抑制MG细胞的增殖(P<0.05),抑制作用随浓度增强;与HG组相比,GEN浓度为5μmol/l、10μmol/L作用24h时即可明显促进HG环境下MG细胞的增殖(P<0.05),促进作用随着时间增强。20μmol/L浓度组在作用48h、72h时对高糖作用下的MG细胞增殖有明显地促进作用(P<0.05),在24h时有明显地抑制作用(P<0.05)。
2.2HG环境对MG细胞矿化能力的影响以及GEN的干预作用
碱性磷酸酶(ALP)染色以及茜素红染色结果显示,与CON组相比,葡萄糖浓度在100μmol/l及以上时会明显抑制MG细胞的碱性磷酸酶的生成,也会相应的抑制成骨矿化。GEN干预后,浓度为5μmol/l、10μmol/l、20μmol/l的GEN对高糖抑制的MG细胞ALP活性以及矿化作用都有非常好的促进作用,而浓度为10μmol/l的干预组效果最佳。
2.3HG环境对MG细胞骨胶原蛋白以及骨形成相关蛋白OCN、RUNX2表达水平的影响以及GEN的干预作用
ICC结果显示,与CON组相比,HG环境下的OCN、RUNX2、COL1A2以及COL-III蛋白荧光强度明显降低。加入5μmol/l、10μmol/l,20μmol/l的GEN干预后,OCN、RUNX2、COL1A2以及COL-III蛋白荧光强度均有不同程度的增高,其中HG+10GEN浓度组的荧光强度增强效果最为显著。
2.4HG环境对MG细胞OPG/RANKL/RANK信号通路相关蛋白表达水平的影响以及GEN的干预作用
WB结果显示:与CON组相比,HG组细胞中OPG蛋白表达以及OPG/RANKL比率明显降低(P<0.05),RANKL蛋白表达水平显著增高(P<0.05);与HG组相比,GEN处理组促进HG环境下MG细胞中OPG蛋白的表达(P<0.05),降低RANKL蛋白的表达水平(P<0.05),上调了OPG/RANKL的比率(P<0.05)。GEN对HG环境引起的OPG蛋白表达降低,OPG/RANKL比率降低,RANKL蛋白表达水平增高有逆转趋势。
【结论】
1.db/db小鼠的体重、血糖和HbAlc均明显增加,伴随骨质减少、骨强度降低,说明db/db小鼠可诱发DOP。
2.给予db/db小鼠GEN饮食干预后,可逆转db/db小鼠血糖升高、HbAlc值增大的情况,改善db/db小鼠的骨骼微环境,增强骨质量,减少骨丢失,抑制骨质疏松的出现。
3.HG环境下会抑制MG细胞的增值以及成骨矿化,给予GEN干预以后,则会抵抗这种抑制作用。
4.GEN可增强骨胶原蛋白以及成骨相关蛋白OCN、RUNX2的表达,同时调节OPG/RANKL/RANK信号通路发挥抑制db/db小鼠骨质疏松的作用。