七氟烷和异氟烷对神经干细胞增殖和迁移的影响

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目的:观察两种吸入麻醉药七氟烷和异氟烷暴露于胎鼠神经干细胞后,是否对神经干细胞的增殖和迁移产生影响。同时,观察这两种药物对神经干细胞发育调控基因(stat3,sox2,notch1和p21)和蛋白表达的影响。  方法:神经干细胞的原代培养:取孕15天(E15)的SD大鼠,将其麻醉后,剥离出胎鼠的大脑皮层,取皮质中的神经干细胞,然后接种到DMEM/F12的完全培养基中培养,细胞接种的密度为(1-2)水106/ml,定时换液或传代,待生长稳定后传代至第三代(P3)随后把P3接种到六孔板中,于4.9%七氟烷和2.8%异氟烷暴露处理6小时。待暴露处理完后,收集细胞继续培养2小时,然后从细胞中提取核酸和蛋白,标本冻存待用。实验被随机分为三组:C组(对照组)(n=6),S组(七氟烷组)(n=6),I组(异氟烷组)(n=6)。采用免疫荧光试剂盒EDU,在药物暴露前加入EDU,待暴露处理6h后,使用试剂盒染色,随后置于荧光倒置显微镜下荧光计数,统计出EDU阳性细胞数;药物暴露处理6小时后加入Cell Counting Kit-8(CCK-8)孵育2小时,随后检测细胞所在培养基的OD值;采用实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)方法,检测待用的冻存标本中各组调节基因(stat3,sox2,notch1和p21)的表达量;采用蛋白免疫印迹技术Western-blot方法检测待用的冻存标本中各组p-stat3,stat3和sox2的蛋白表达。此外,七氟烷和异氟烷暴露后的细胞接种到transwell板中作用24小时,检测各组穿过transwell膜的细胞数量。  结果:EDU结果显示,神经干细胞在异氟烷和七氟烷急性暴露处理后,与正常对照组(C组)相比,异氟烷组(I组)和七氟烷组(S组)细胞增殖数量减少(P<0.05),通过PCR检测四种神经干细胞发育调控相关基因,发现与正常对照组(C组)相比,异氟烷组(I组)和七氟烷组(S组)的sox2,notch1,p21的mRNA的表达量无差异(P>0.05)。然而异氟烷组的stat3基因mRNA的表达量降低(P<0.05)。Western-blot检测显示,与正常对照组(C组)相比,异氟烷组和七氟烷组p-stat3蛋白表达降低(P<0.05),而stat3蛋白没有明显改变(P>0.05)。迁移结果显示,与与正常对照组(C组)相比,transwell膜中异氟烷组和七氟烷组的细胞数量增加(P<0.05)。  讨论:七氟烷和异氟烷的急性暴露对神经干细胞增殖具有抑制作用,对神经干细胞迁移具有促进作用。其机制可能为七氟醚与抑制stat3蛋白磷酸化有关,而异氟醚不仅抑制了stat3蛋白磷酸化,而且抑制了stat3基因的转录。进而通过下游效应蛋白影响增殖和迁移。
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