一株植物乳杆菌的分离鉴定及其益生效能研究

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目的:既往研究显示乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)在发酵食品、乳制品、预防治疗药物等领域的应用和开发有重要意义。本文通过微生物培养和分子生物学技术从中国传统泡菜水标本中分离筛选鉴定出了一株具有益生功能的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum T1),并结合体外RAW264.7巨噬细胞炎症模型,验证了分离株L.plantarum T1对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导RAW264.7巨噬细胞炎症反应的缓解情况,并探讨了其抗炎作用机制。方法:1、LAB的分离和鉴定:将泡菜水标本混合均匀进行梯度稀释后涂布于含Ca CO3的MRS固体培养基上,于37℃厌氧培养箱中培养48~72h。观察菌落形态并挑选形态与LAB相似的菌落进行纯培养,通过革兰染色观察菌株染色特性,并利用16S r DNA序列进行初步鉴定,对所得菌株进行进化树分析。2、通过益生功能评价筛选发挥益生功能的LAB:体外评价菌株耐胃酸耐胆盐、拮抗病原微生物效果等特性,综合所得结果筛选出一株具有良好益生活性的L.plantarum T1,并对该菌株进行了生长曲线绘制和生化鉴定。3、L.plantarum T1的抗炎能力的检测:(1)RAW264.7巨噬细胞经不同浓度LPS诱导后,利用Western blot和定量逆转录PCR(quantitative reverse transcription,q RT-PCR)法检测炎症因子的表达情况,以确定好LPS有效诱导炎症的合适浓度。(2)细胞增殖及毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测L.plantarum T1无细胞发酵上清液(Cell-free supernatant,CFS)对RAW264.7巨噬细胞的毒力影响,添加安全范围内不同剂量的L.plantarum T1 CFS(6Log、7Log、8Log CFU/m L)干预4h,地塞米松(Dexamethasone,DEX)(50μg/m L)作为抗炎阳性对照药物同时干预4h,再经LPS诱导20h后,通过Griess法检测细胞上清液中一氧化氮(Nitric oxide,NO)分泌水平,q RT-PCR法检测炎症因子白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、诱导性一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,i NOS)、环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)的m RNA表达水平,免疫荧光法检测IL-1β的表达情况,Western blot检测i NOS、COX-2的蛋白表达情况。4、L.plantarum T1 CFS发挥抗炎作用机制的探讨:(1)L.plantarum T1是否影响活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的产生。利用流式细胞仪检测装载荧光探针2′,7′-二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)后不同处理组RAW264.7巨噬细胞ROS的释放水平。另外,利用TBA法与WST-8法分别评估丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活性变化水平。(2)探究NF-κB和MAPK信号通路是否参与了L.plantarum T1CFS缓解LPS诱导巨噬细胞产生的炎症反应。不同剂量的L.plantarum T1 CFS(6Log、7Log、8Log CFU/m L)干预4h,DEX(50μg/m L)作为抗炎阳性对照药物同时干预4h,再经LPS诱导4h,通过Western blot检测核转录因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)和有丝分裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase,MAPK)信号通路相关蛋白的表达情况。结果:1.从泡菜中筛选出L.plantarum T1,该菌株具有较好的耐酸耐胆盐能力,L.plantarum T1 CFS对革兰阴性致病菌大肠埃希菌(Escherichia coli)ATCC25922和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC27853标准菌株,以及革兰阳性致病菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC25923标准菌株具有很好的拮抗效果。2.L.plantarum T1 CFS通过抑制促炎症因子分泌而发挥抗炎作用。3.L.plantarum T1 CFS通过抑制过度氧化应激以及下调NF-κB和MAPK通路中磷酸化蛋白的激活来缓解LPS诱导的炎症反应。结论:从泡菜中分离出来的L.plantarum T1 CFS具有拮抗病原微生物的能力,能够通过抑制氧化应激、调控NF-κB和MAPK信号通路而缓解LPS诱导产生的炎症反应。
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