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在自然界中,一种介体昆虫通常能传播一种或者几种植物病毒。不同的介体昆虫传播病毒效率是不同的,其获毒和传毒水平的差异体现了介体昆虫与病毒之间的亲和性。影响或决定该亲和性的因素包括昆虫的遗传背景、组织和膜屏障、共生菌、以及RNAi(RNA interference)抗病毒免疫反应。研究表明,南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarfvirus,SRBSDV)的潜在传毒介体灰飞虱(Laodelphax striatellus 的RNAi抗病毒免疫途径调控了病毒与灰飞虱的亲和性。水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus,RDV)是呼肠孤病毒科(Reovididae)植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)的成员之一,主要由黑尾叶蝉(Nephotettix cincticeps)以持久增殖方式传播,也可由其它叶蝉,如电光叶蝉(RRecilia dorsalis),以较低的效率传播。先前的研究证明,在分子水平上,负责装配成小管结构并协助病毒扩散的RDV非结构蛋白Pns10与电光叶蝉胞质型actin不互作,导致包裹病毒粒体的Pns10管状结构无法在电光叶蝉体内进行有效扩散,最终造成电光叶蝉传播RDV的效率较低。最近的研究发现,RDV同属的水稻瘤矮病毒(Ricegall dwarfvirus,RGDV)的侵染,可激活高亲和性介体电光叶蝉培养细胞和介体昆虫的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抗病毒天然免疫途径,确认了电光叶蝉的siRNA途径对高亲和性的病毒侵染的调控作用。那么电光叶蝉的siRNA途径对低亲和性的RDV侵染是否也有调控作用?因此本研究以RDV与电光叶蝉病原系统为研究对象主要做出以下探索:(1)利用显微注射方法、免疫荧光标记并结合生物学方法,验证RDV在电光叶蝉体内侵染循回过程,以及RDV在电光叶蝉体内受到的中肠和唾液腺屏障。进一步证明中肠屏障是限制RDV在电光叶蝉体内有效扩散的关键。(2)利用电光叶蝉培养细胞体系,对侵染病毒后的样品通过small RNA测序,发现病毒的侵染诱导产生的病毒来源的小干扰RNA(viral-derivered small interfering RNA,vsiRNA)分布特征以及RNA途径相关基因:Argonaute 1(AGO1)、Argonaute 2(AG02)、Dicer 1(DCR1)、Dicer 2(DCR2)、systemic RNA interference defective-1(SID)和 P-element induced wimpy testis(PIW1)的表达特征等相关信息;(3)利用体外合成RNAi途径相关基因双链RNA(double-strands RNA)dsRNA,在叶蝉培养细胞诱导RNAi的发生,初步筛选RNAi途径调控RDV侵染的关键基因:siRNA途径的DCR2和AGO2基因;利用显微注射方法体外诱导RNAi反应,沉默DCR2和AG02基因的表达,发现RDV在电光叶蝉体内侵染、复制增殖水平以及传毒率都明显提高。结果表明siRNA途径调控RDV在介体电光叶蝉的获毒、传毒过程,调控RDV与电光叶蝉的亲和性关系。综上所述,本实验利用昆虫培养细胞体系、体外诱导RNAi的技术、免疫荧光、显微注射、western blot和RT-qPCR等手段明确了 RDV在电光叶蝉体内的侵染除了膜屏障外还受到机体RNAi免疫屏障的制约,该免疫反应发挥关键作用因子是siRNA途径的DCR2和AG02基因。在培养细胞内沉默DCR2和AG02基因的表达,可提高RDV在电光叶蝉培养细胞中侵染、复制能力;在虫体内干扰DCR2基因的表达,可提高RDV在电光叶蝉获毒、传毒能力。因此,siRNA抗病毒免疫途径调控了 RDV与介体电光叶蝉的亲和性。本研究有利于研究病毒与介体昆虫互作关系,有助于探索新途径、新策略阻断水稻矮缩病毒的介体传播过程,为防治水稻矮缩病毒病的发生提供一定的理论基础。