面向高灵敏miRNA检测的三元非对称多孔纳米检测器研究

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Micro RNAs(miRNAs)在临床诊断和治疗中是一种很有前途的肿瘤筛查和诊断的标志物,发展简单快速、灵敏度高、特异性好的检测方法对推动肿瘤标志物miRNA的早期检测具有重要意义。由纳米材料构建的荧光生物传感器在生物标志物的检测领域中得到了广泛的应用。基于核酸适配体技术和纳米荧光淬灭剂的miRNA检测,在肿瘤标志物早期快速检测中潜力巨大。然而,目前大多数纳米淬灭剂的外表面积有限,颗粒能够携载的荧光适配体量受到极大的限制。目前的检测体系大都采用在检测时于液相同步外加DNA酶,可能会堵塞纳米淬灭剂孔道,干扰荧光强度的检测。另外,游离酶反应条件严格且易失活。以上检测体系的缺点在一定程度上限制“智能”纳米传感器的设计。而如何克服现有检测体系的缺点,是值得研究的问题。本论文将纳米材料与核酸适配体及核酸酶辅助信号放大的优势相结合,构建基于介孔聚多巴胺(mesoporous polydopamine,MPDA)-金(Au)纳米颗粒-DNA外切酶的三元非对称纳米传感器,用于生物体系中高灵敏度miRNA的检测。其中,PDA纳米颗粒作为一种优异的荧光淬灭剂,其能形成介孔结构来保护吸附的单链DNA探针。在酶固定模块的选择上,金纳米颗粒与PDA表面修饰方法成熟,并且基于Au-S配位键的表面修饰利于实现选择性DNA酶偶联。具体来说,该三元非对称纳米传感器由MPDA-Au-酶构成。其中,MPDA侧作为“传感单元”来指导由靶miRNA结合和异源双链体释放控制的荧光恢复,而Au侧是固定化酶切的目标循环的“扩增单元”。主要研究内容如下:(1)非对称MPDA-Au纳米颗粒的可控制备和纳米尺度非对称复合的规律探索首先,对MPDA纳米颗粒进行形貌和结构的探索和研究。用表面活性剂(Pluronic(?)F127,F127)为模板合成尺寸约200 nm的具有孔结构的MPDA颗粒。通过进一步控制PDA的聚合速度,调整反应物配比、添加速度等因素的控制对颗粒和孔结构进行调控,得到尺寸约为100 nm,具有丰富孔结构的MPDA颗粒。然后,对非对称结构颗粒形貌进行精细调控的研究。采用静电排斥法制备非对称MPDA-Au,基于儿茶酚基团对金属离子的螯合和还原作用非对称地生长金纳米颗粒,成功构建出由MPDA部分(约200 nm)和Au部分(约30 nm)组成的非对称MPDA-Au纳米颗粒。此外,探究金纳米颗粒在MPDA表面选择性生长的影响因素和控制规律,得到金颗粒大小可调的一系列非对称纳米颗粒。另根据皮克林乳液介导的颗粒表面生长方法,保护主体MPDA纳米颗粒的部分表面,实现客体Au颗粒的选择性生长,成功构建出由MPDA部分(约100 nm)和Au部分(约30 nm)组成的非对称MPDA-Au纳米颗粒。这为纳米材料的设计提供新思路。(2)MPDA-Au-酶三元非对称纳米传感器构建和miRNA检测应用在MPDA-Au非对称形貌基础之上,通过金和二硫键配体的特异性结合,在金颗粒表面选择性修饰特异性结合DNA酶,最终得到集合适配体携载、miRNA识别响应、循环、信号放大功能于一体的MPDA-Au-酶三元非对称纳米传感器。后续研究非对称纳米淬灭剂的荧光猝灭效应规律,以及基于非对称的酶修饰的协同信号放大规律以及miRNA检测性能评价。纳米检测器最低检测限为32.0 f M,具有优异的选择特异性。除此之外,该传感器具有在复杂生物样品中检测微量目标miRNA的可行性。综上,本论文成功构建基于MPDA-Au-酶的三元非对称纳米传感器,该体系实现对非对称纳米材料形貌的精细调控,集成功能模块于一体的材料构筑,面向miRNA检测领域其表现出高灵敏和特异性的检测性能。这为基于纳米猝灭剂的复合材料构建提供一种全新的策略,也为高性能miRNA纳米荧光检测器的开发提供具有参考价值的新思路和新模式。
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