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研究目的黏液纤毛清除系统(MCC)是呼吸道防御各种吸入性病原微粒的第一道防线,纤毛上皮细胞和分泌细胞是构成MCC的两大主要成分,其中能够运动的纤毛是MCC的主要动力来源,对于维持该防御功能完整性具有关键意义。鼻炎、鼻窦炎、Kartagener综合征、囊性纤维化和慢性阻塞性肺疾病等众多呼吸道疾病的发生发展均与纤毛功能密切相关,在这些疾病中,原发或继发的纤毛运动功能障碍会丧失有效的黏液驱动力,使病原体和炎性介质在气道中累积,因此使这些疾病反复发作、迁延不愈,研究和明确纤毛运动的影响因素和调控机制对于纤毛相关疾病的诊断和治疗具有重要意义。自纤毛运动被发现的近60年间,对于纤毛运动的了解和认知主要是通过离体实验,而离体实验很可能无法确切反映纤毛在体内的实际功能状态。本研究旨在建立一种准确有效的在体纤毛运动成像方法,以分析在体和离体纤毛运动功能的差异以及各种因素对在体纤毛运动的影响,这些研究结果可能有助于纤毛相关疾病的临床诊断和治疗方案的发展。研究方法1.利用新型数码显微系统结合高速显微摄影技术建立小型实验动物在体鼻黏膜纤毛运动成像系统,该系统系首次直接拍摄到在体纤毛运动影像,且图像清晰、稳定性好,联合应用成熟的高速显微摄影及图像分析技术可精确获取纤毛运动参数纤毛摆动频率(CBF)和纤毛摆动距离(CBD),实验结果精确,可重复性较高。2.对比分析实验动物在体纤毛运动在基础值、随时间变化和随温度变化反应方面与离体纤毛样本之间的异同。3.以卵清蛋白(OVA)作为致敏原建立大鼠过敏性鼻炎(AR)模型,观察AR病理状态下在体纤毛运动功能改变,并研究过敏原卵清蛋白和组胺对在体纤毛运动的影响。4.建立大鼠鼻后神经切断术(PNN)模型,观察PNN可能对正常及AR鼻黏膜产生的组织形态学和在体纤毛运动功能影响。研究结果1.应用数码显微系统联合高速显微摄影技术和图像分析技术建立的小型实验动物在体鼻黏膜纤毛运动成像分析系统能够有效实现大范围在体纤毛运动成像和观察。在放大100倍的视野中即可发现纤毛摆动区域,放大500~1000倍时观察效果较好。观察到的影像表现为大范围区域性纤毛摆动驱动黏膜表面液体,形成节律性同步运动的异相波,与经典的纤毛运动描述相符。通过图像分析技术能够精确获取纤毛运动CBF和CBD参数。2.豚鼠在体纤毛运动中位CBF(IQR)为9.95(8.14–11.31)Hz,高于动物死亡后原位纤毛7.74(6.53–10.31)Hz(P=0.022)、离体黏膜8.24(6.59–9.46)Hz(P=0.045)和离体细胞7.91(5.77–9.69)Hz(P=0.022)。相较于在体纤毛,动物死亡后原位CBF即刻降低22.2%,离体黏膜低17.2%,离体细胞低20.5%。本在体测量结果高于许多传统纤毛离体研究报道的CBF(7.49-9.2Hz)。离体黏膜和离体细胞在进入离体环境后12小时内CBF会呈现升高-平台期-降低的变化规律,CBD呈逐渐下降趋势,而在体纤毛CBF和CBD全程较为稳定。离体标本CBF在0~40℃温度范围内变化曲线呈“S”形,线性期斜率离体黏膜为0.51±0.02Hz/℃,离体细胞为0.48±0.03Hz/℃,在体纤毛运动随温度变化曲线与离体样本明显不同,线性期斜率较平缓为0.18±0.01Hz/℃,显著低于离体样本(P<0.001)。3.SD大鼠卵清蛋白致敏后可观察到鼻纤毛部分脱落、融合,在体纤毛CBF和CBD降至正常的57.8%和73.1%,应用抗组胺药物马来酸氯苯那敏后可使CBF恢复至正常的79%。短时间组胺(小于30min)对纤毛运动有刺激增强作用,过敏原卵清蛋白溶液和长时间组胺(大于30min)则对纤毛运动具有抑制作用。相比于正常纤毛,过敏原卵清蛋白溶液和长时间组胺的抑制作用对AR纤毛有所减弱。4.PNN手术可导致鼻黏膜明显去神经化,但对卵清蛋白致敏造成的纤毛形态和功能损害无明显影响;正常纤毛在PNN术后CBF和CBD有所降低(P<0.05);α受体激动剂会抑制在体纤毛运动,乙酰胆碱和β受体激动剂会使在体纤毛运动增强,PNN并未改变纤毛对这些神经递质的反应性。结论1.本研究建立的实验动物在体鼻黏膜纤毛运动成像和分析系统首次获取了在体纤毛运动高速影像,利用图像分析技术可准确测量纤毛运动参数。2.在体和离体纤毛运动在基础值、时间稳定性和随温度变化方面具有明显差异。应用在体纤毛运动分析方法所得结果更接近生物体内实际生理状态。3.卵清蛋白致敏会导致纤毛形态损害和运动减弱,短时间组胺对在体纤毛运动具有增强作用;卵清蛋白和长时间组胺对正常在体纤毛具有抑制作用,但不会使卵清蛋白致敏后的纤毛运动进一步减弱。4.PNN手术会导致鼻黏膜明显去神经化,但并未影响卵清蛋白致敏造成的纤毛损害,且会降低正常纤毛运动基础值,可能因此降低鼻黏膜防御功能。乙酰胆碱和β肾上腺素激动剂对在体纤毛运动具有增强作用,α肾上腺素激动剂对在体纤毛具有抑制作用。PNN影响的是这些神经递质的合成,并未影响相关受体的表达和功能。