研究背景:关节软骨损伤的修复一直是骨科领域的研究热点与难题,流行病学资料显示膝关节镜下的损伤率高达60%左右。目前尚缺乏能够理想修复软骨并能维持长期稳定疗效的手段,任何技术都难以恢复、再造正常透明软骨的结构及其生物学性能。目前研究占比最高的仍属组织工程技术,临床一线疗法仍是微骨折技术。随着再生医学深入发展,越来越多膝关节内及周围的组织特异性、内源性干祖细胞被发现、表征及研究用于软骨损伤的修复。最新发表于Nature Medicine的研究显示微骨折技术通过激活损伤局部的骨骼干细胞促进软骨损伤修复,为软骨损伤治疗提供了新思路。追溯微骨折及组织工程技术的治疗机理,干细胞活力都是影响软骨损伤修复效果的核心要素之一。作为微骨折技术的操作靶点-软骨下骨区域,软骨下骨干祖细胞也得到越来越多关注。研究提示其也是软骨损伤修复的种子细胞之一,但其与经典骨髓间充质干细胞的生物学特性差异尚不十分明确,体内修复效能尚不清楚。发散式冲击波,作为特有的机械应力刺激之一,与再生医学的结合越来越紧密。众多研究结果显示冲击波产生的微能量能够调控干细胞的生物学性能,促进损伤修复。本课题组前期也做了相应工作,我们的研究显示适宜能量的冲击波刺激能够增强经典骨髓间充质干细胞的干性及其修复效能,但其作用机制尚不清楚。此外,冲击波刺激既可作为组织工程增强干细胞修复效能的工具,还具有损伤局部原位应用促进组织修复的潜力。研究目的:首先比较配对的软骨下骨干祖细胞及经典的骨髓间充质干细胞,进一步明确其生物学特性差异。其次,应用发散式冲击波直接刺激探究不同参数对应不同能量刺激对软骨下骨干祖细胞干性的影响,并对其机制做初步探索,利用兔子骨软骨损伤模型,基于组织工程思路探究软骨下骨干祖细胞本身及最佳能量冲击波预处理后的体内修复效能。最后,通过巴马猪股骨内髁软骨损伤模型,基于临床一线疗法微骨折技术,联合冲击波原位刺激,并与经典的组织工程技术比较,以期探索一种临床易于应用、效果更佳的软骨损伤修复技术。研究方法:第一部分:取临床配对的膝关节软骨下骨组织及骨髓血分离、培养、表征软骨下骨干祖细胞及骨髓间充质干细胞,利用流式技术比较两种细胞的免疫表型,利用CFU-F及CCK8比较二者的自我更新及增殖潜能,通过三系诱导分化,从细胞染色及基因表达水平比较二者的多向分化潜能,利用Transwell实验比较二者的迁徙潜能。第二部分:1.基于软骨下骨干祖细胞自我更新潜能的最佳冲击波参数筛选:（1）于悬浮刺激系统中应用不同参数组合的发散式冲击波直接刺激软骨下骨干祖细胞,基于自我更新潜能CFU-F检测筛选最佳的刺激参数;（2）选定刺激参数后,应用CCK8及流式检测探究本体系中最佳刺激参数对软骨下骨干祖细胞增殖、凋亡的影响;（3）应用细胞染色及三系分化相关基因表达检测探究基于自我更新筛出的最佳冲击波刺激对软骨下骨干祖细胞多向分化潜能的影响;2:基于组织工程思路的体内修复效能验证:利用兔子骨软骨损伤模型,通过6周与12周两个时间点取材的组织病理学检测,探究软骨下骨干祖细胞本身及最佳能量冲击波刺激后的体内修复效能;3:发散式冲击波增强软骨下骨干祖细胞自我更新的机制初探:（1）基于不同参数刺激对软骨下骨干祖细胞自我更新影响的结果,选择以下四组:空白对照组,1A（1bar,300次）,2B（2bar,600次）及3D（3bar,1200次）,首先利用蛋白印迹技术（Western blot）,探究以上组别中YAP/TAZ蛋白的表达情况;（2）选择本体系中的最佳能量组2B进行正反验证实验,在YAP特异性抑制剂维替泊芬安全浓度筛选完成后,通过分组设计:空白组,冲击波刺激组,冲击波刺激+维替泊芬组,通过CFU-F表征各组自我更新潜能变化,利用激光共聚焦观察各组YAP蛋白的核转位情况,并观察与自我更新密切相关的Nanog、Sox2蛋白的表达情况。此外,应用PCR技术检测各组自我更新基因的相对表达情况;（3）利用高通量转录组测序探索最佳发散式冲击波刺激对软骨下骨干祖细胞基因表达的影响。第三部分:以巴马猪股骨内髁软骨损伤为模型,设置空白对照组、微骨折组、微骨折+冲击波孔周刺激组、微骨折+冲击波孔内刺激组、组织工程组及Sham组,术后3个月获取各组修复组织,行MRI、CT、生物力学及病理学检测,评估分析各组修复效果。研究结果:第一部分:软骨下骨干祖细胞与骨髓间充质干细胞呈现相似的细胞形态,都符合目前国际细胞治疗协会关于干细胞鉴定的最低标准;软骨下骨干祖细胞的自我更新潜能及增殖能力强于骨髓间充质干细胞;软骨下骨干祖细胞的成软骨、成骨潜能强于骨髓间充质干细胞,成脂能力不及骨髓间充质干细胞;骨髓间充质干细胞的迁徙潜能强于软骨下骨干祖细胞。第二部分:1.发散式冲击波刺激能够剂量依赖性影响软骨下骨干祖细胞的自我更新潜能,我们基于自我更新潜能,筛选出本体系中的最佳能量参数（2bar,600次）;筛出的最佳冲击波刺激能够增强软骨下骨干祖细胞的增殖潜能,对凋亡无明显影响;能够抑制软骨下骨干祖细胞的成脂潜能,对成骨潜能无显著影响,对成软骨潜能有增强趋势,但尚未达统计学差异;2.最佳冲击波能量预处理的软骨下骨干祖细胞呈现出更强的软骨修复效能;3.YAP/TAZ参与了冲击波介导的增强软骨下骨干祖细胞自我更新潜能的生物学效应,高通量分析提示其它一些自我更新相关的通路可能也参与了此生物学过程。第三部分:基于修复组织的病理学、影像学检测及生物力学测定结果的综合分析,与单纯微骨折组相比,微骨折+孔周刺激组修复效果未见明显改善。微骨折+孔内冲击波刺激能够显著改善单纯微骨折术的治疗效果,且与组织工程组相比,修复效果未见显著差异。研究结论:1.软骨下骨干祖细胞是软骨损伤修复的潜在细胞类型之一;2.发散式冲击波刺激剂量依赖性影响软骨下骨干祖细胞的自我更新潜能,最佳能量的发散式冲击波刺激能够增强软骨下骨干祖细胞的体内软骨修复效能;3.YAP/TAZ参与了发散式冲击波介导的增强软骨下骨干祖细胞自我更新的生物学过程;4.冲击波作为一种体外刺激工具可以增强以干细胞为核心要素之一的组织工程修复效果;微骨折基础上的联合孔内冲击波刺激有望为软骨损伤修复提供一种新的、效果更佳的技术,但其具体机制尚需进一步探究。5.冲击波能量是冲击波生物学效应的关键,因此精准能量冲击波参数的表征仍需进一步深入探究;在不同修复场景中冲击波刺激的参数,作用方式仍需进一步探究。