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Apelin是G蛋白偶联受体APJ（apelin receptor）的内源性配体。Apelin和APJ在中枢神经系统和外周组织中广泛表达,包括心脏、大脑、肾脏、肝脏和脂肪组织。有研究表明慢性肝病患者血清apelin的水平显著升高。在肝硬化患者的肝组织中,APJ的表达显著增加。Apelin-APJ在器官纤维化中的作用存在争议,Apelin-APJ已被证实可以减轻肾脏和心肌纤维化,但却可以促进肝纤维化。有研究证明阻断APJ可以减缓四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化的进展。Apelin在肝硬化大鼠的肝组织中表达增加。在体外培养的肝星状细胞（HSCs）中,apelin可以增加Ⅰ型胶原蛋白和血小板衍生生长因子受体β的合成。最近有研究表明APJ也是个机械敏感性受体。在胆汁淤积过程中,胆管上皮细胞受到来自胆道内压升高的机械应力。胆管上皮细胞是胆管疾病如原发性胆汁性肝硬化（PSC）,原发性硬化性胆管（PBC）和胆管癌（CCA）的致病细胞,其特点是胆管上皮细胞的损伤和增殖。在胆汁淤积性肝病中,胆管上皮细胞在胆管损伤与肝纤维化之间起关键作用。本课题目的是探讨apelin-APJ是否在胆汁淤积性胆管上皮细胞增殖和肝纤维化中发挥作用,并且从APJ作为机械敏感性受体等角度,探讨apelin-APJ调节胆管上皮细胞增殖和肝纤维化的作用机制。方法:体内实验,雄性C57BL/6（WT）小鼠进行胆管结扎手术（BDL）或假手术,APJ拮抗剂ML221（150 μg/kg,经尾静脉注射隔天一次）或生理盐水处理1周。雄性WT小鼠和apelin敲基因（Apelin-/-）小鼠,BDL或假手术处理1周。处死各组动物,收集血清、肝组织和免疫磁珠分离胆管上皮细胞,检测小鼠血清apelin的水平和肝功能生化指标,检测小鼠肝组织胆管上皮细胞增殖和肝纤维化的情况。用激光捕获微切技术（Laser Capture Microdisectio,LCM）分离小鼠HSCs并检测增殖相关基因和HSC活化相关基因的表达。体外实验,检测PSC病人肝脏分离出的胆管上皮细胞（hPSCL）apelin基因APLN、APJ基因APLNR、miR-16和Nox4 mRNA的表达。用Flexcell FX-6000真空牵拉系统对人原代胆管上皮细胞（HIBEpiCs）模拟机械应力的作用,检测机械应力对胆管上皮细胞apelin合成、分泌和纤促维化基因表达的影响。用apelin-13（apelin活性片段）刺激HIBEpiCs,检测apelin对胆管上皮细胞增殖的作用并研究其机制。用apelin-13刺激人肝星状细胞（HHStecs）,检测apelin对HSCs活化和增殖的作用并研究其机制。结果:BDL小鼠血清和胆管上皮细胞上清液中apelin的水平较WT小鼠显著升高,但BDL+ML221小鼠血清和胆管上皮细胞上清液中apelin的水平较BDL小鼠显著降低。hPSCL中APLN和APLNR的表达较HIBEpiCs显著增加。机械牵拉的HIBEpiCs细胞培养基和细胞裂解液中apelin的水平较没有牵拉的细胞明显升高,但机械牵拉的同时用ML221预处理HIBEpiCs,细胞培养基和细胞裂解液中apelin的水平较单纯牵拉组显著降低。BDL小鼠胆管上皮细胞中miR-16的表达较WT小鼠显著减少,而BDL+ML221小鼠胆管上皮细胞miR-16的表达较BDL小鼠显著增加。hPSCL中miR-16的表达较HIBEpiCs显著减少。转染了 miR-16 Mimic的HIBEpiCs在机械应力的作用下,细胞培养基和细胞裂解液中apelin的水平较转染Mimic对照的HIBEpiCs显著减少。免疫组化的结果显示,与WT小鼠相比,BDL小鼠肝脏组织中胆管上皮细胞增殖增加,而在BDL+ML221和apelin-/-BDL小鼠肝脏组织中胆管上皮细胞的增殖较BDL小鼠显著减少。体外实验中,apelin-13刺激下HIBEpiCs增殖能力增强和细胞中PCNA和Ki67 mRNA的表达增加。Nox4 mRNA的表达、细胞裂解、上清液中ROS的水平和ERK的磷酸化水平在BDL小鼠胆管上皮细胞中较WT小鼠显著增加,但在BDL+ML221小鼠胆管上皮细胞中较BDL小鼠显著减少。hPSCL中Nox4 mRNA的表达较HIBEpiCs显著增加。Apelin-13刺激的HIBEpiCs Nox4 mRNA的表达、细胞内ROS的生成和p-ERK的表达较对照组显著增加。ML221、Nox4抑制剂DPI、ROS抑制剂NAC或ERK抑制剂PD98059预处理HIBEpiCs,可以显著减弱apelin-13的促细胞增殖能力。天狼猩红染色和羟基脯氨酸检测结果显示,BDL+ML221和apelin-/-BDL小鼠肝脏组织中胶原沉积较BDL小鼠显著减少。免疫荧光结果显示,与WT小鼠相比,BDL小鼠肝脏组织中HSCs的标志蛋白desmin和活化标志蛋白α-SMA表达显著增加。但在BDL+ML221和apelin-/-BDL小鼠肝脏组织中,desmin和α-SMA的表达较BDL小鼠显著减少。LCM分离的BDL+ML221小鼠HSCs中,PCNA、Ki67、α-SMA 和 Collal（collagen 1）mRNA 的表达较 BDL 小鼠显著减少。体外实验中,apelin-13刺激下HHStecs增殖能力增强,细胞中PCNA、Ki67、α-SMA和Collal mRNA的表达显著增加。但NAC预处理HHStecs,减弱了apelin-13的促细胞增殖能力和减少细胞中PCNA、Ki67、α-SMA和Collal mRNA的表达。结论:在胆汁淤积过程中,机械应力通过机械敏感性受体APJ下调miR-16的表达促进胆管上皮细胞合成和分泌apelin;Apelin-APJ通过Nox4-ROS-ERK信号通路促进胆管上皮细胞增殖;Apelin-APJ促进细胞内ROS生成,诱导肝星状细胞增殖和活化,促进肝纤维化。Apelin-APJ在胆汁淤积性胆管上皮细胞增殖和肝纤维化中起重要作用。