脓毒症（sepsis）是一种全身炎症反应综合征,多由感染、严重创伤引起,是急重症病房最经常遇到的难题之一。脓毒症的发病机制较复杂,炎症反应和感染加重是其主要的诱因。脓毒症发生时,机体在释放促炎介质的同时也释放抗炎介质,任何一方的过度优势均可以造成炎症失控。促炎介质为主的状态为全身炎症反应综合征（SIRS,Systemic Inflammatory Response Syndrome）,抗炎介质为主的状态为代偿性抗炎反应综合征（compensatory anti-inflammatory response syndrome,CARS）,二者均亢进紊乱的状态为混合性拮抗反应综合征（mixed antagonist response syndrome,MARS）。脓毒症的早期往往以 SIRS 的促炎状态为主,晚期则以CARS的抗炎介质为主。早期SIRS引起炎症细胞活化、炎症介质生成。晚期CARS限制炎症,保护宿主免受损害,体现机体促炎/抗炎平衡的重要性。在该过程中细胞因子扮演着重要角色。病原体的病原分子被分子模式识别受体接合,通过下游的信号通路,激活免疫细胞,短时间内释放大量的炎性因子,形成“细胞因子风暴”。正常情况下,机体能够调控该过程,控制因子风暴的程度和范围。但在受到较强烈的冲击时,可能会发生异常情况。该调控失灵,细胞因子风暴变得不可控,造成体内多种器官和组织的损伤。细胞因子风暴的不可控正是造成脓毒症患者死亡的主要原因。外泌体（exosomes）是直径大小为30-120nm的膜性囊泡,由细胞内部的胞内体与细胞膜融合释放到细胞外所形成。Exosomes目前已经被应用到诊断、治疗、药物携带等多方面。在免疫方面,由于其低免疫性和传递的唯一性,MVs在药物的转运方面起到重要的作用,有研究证实exosomes能够转运基因物质以进行细胞与细胞之间的交流。Exosomes在调控治疗方面已经开始出现应用,主要在三个方面:免疫治疗、RNA干扰技术和药物传递,应用最广的就是免疫治疗。Exosomes在免疫应答过程中与周围免疫细胞相互作用,在抗原呈递和T细胞的激活方面扮重要角色,研究证实B淋巴细胞能够分泌exosomes,并且该exosomes包含能够在体外介导细胞应答的MHC-Ⅱ。目前脓毒症过程中的外泌体的研究也有一些报道,但缺乏更深入的探讨。Th1/Th2的平衡消长是机体免疫反应调节的基本方式。正常情况下机体存在多种调节平衡途径,包括CD4/CD8通过比例变换调节,细胞凋亡调节免疫细胞的数量、CD8淋巴细胞通过杀伤作用的调节、Th17/TREG细胞对于免疫系统变化的调节等。但目前最主要的仍是Th1/Th2平衡变化的调节,其对于特异性的免疫平衡作用至为关键。IFN-γ、IL-12是促进Th0向Th1细胞分化的关键因子。IL-4是促进Th0向Th2细胞分化的关键。Th1/Th2两个细胞亚群相互依存、相互对立、相互约束。Th1/Th2的漂移是指Th1/Th2之间的功能和作用存在平衡,体内的微环境能够影响其向两个方向的分化,每类亚群扩增的同时可以抑制另一个亚群。在脓毒症的进展中,Th1/Th2的漂移失衡扮演了重要角色,在脓毒症的早期往往以细胞免疫为主,I型反应占据主导地位,促进炎症的发生,消灭病原体。随着病情进展,脓毒症中晚期以体液免疫为主,抑制免疫细胞杀菌活性,抑制免疫反应,保护组织不被损伤。因此调节Th1/Th2平衡是目前研究脓毒症治疗的热点。目前在exosomes调控T细胞的激活、分化、增殖等方面有了一系列研究报道。尤其在各种炎性疾病中,其对于免疫应答以及抗原呈递方面扮演重要角色。细胞因子在脓毒症的进展中扮演了如此重要的角色,但目前对其研究尚不完全透彻。在本次研究中,我们设想细胞因子在血清中是否存在其它的传递方式?Exosomes作为在血清中大量存在的介导信号交流的囊泡,它是否包含有大量的细胞因子,其所包含的因子与血清中的因子的变化是否一致?并且该类细胞因子的存在对于免疫功能的调控又有什么样的作用呢?本研究对脓毒症小鼠血清中存在的这些exosomes进行了探索,以期能够为脓毒症的认识和解决提供新的思路。研究目的:本研究从脓毒症小鼠不同时间点（0h、2h、12h、24h、48h）血清中提取exosomes,测定并分析其特性。检测其所包含的细胞因子含量,与血清中细胞因子的变化进行差异比较。通过与淋巴细胞等免疫细胞作用,进一步阐明该类因子发挥作用的机制。通过动物实验,验证其是否能对脓毒症小鼠起到保护作用。研究方法:本研究以脓毒症小鼠血清中的exosomes为研究对象,通过超速差速离心结合过滤的方法进行提取,电镜、Nanosight、Western blot对其进行检测验证。用Luminex细胞因子检测系统检测在不同时间点提取的exosomes内所包含的细胞因子的浓度。将exosomes与提取的小鼠脾脏淋巴细胞进行孵育,流式细胞术检测其对T细胞的分化能力的影响,检测其对于淋巴细胞增殖能力的影响。通过Transwell实验和air pouch实验检测exosomes对于淋巴细胞的趋化能力。通过小鼠尾静脉注射exosomes,观察其对脓毒症小鼠的保护作用。研究结果:1.脓毒症小鼠不同时间点（0h、2h、12h、24h、48h）的血清提取的exosomes,在电子显微镜下观察其形态,显示大小在50-120nm左右。Western blot检测其表面标志蛋白分子CD9、CD63、CD81均有表达。Nanosight检测到的exosomes的运动轨迹反应出囊泡颗粒大小不一,均在200nm以下,以91nm左右的颗粒最多。2.在不同的时间点所提取的exosomes总蛋白浓度有显著性差异（F=9.813,P=0.000）。进行组间两两比较发现,与对照组（0h）相比,12h、24h、48h组所提取的exosomes的蛋白浓度升高明显,差异均具有统计学意义（P=0.020、0.000、0.000）。并且随着时间,exosomes的蛋白浓度先升高后降低,在48h达到高峰。用Nanosight检测不同时间点血清中的exosomes的颗粒密度,在不同的时间点所提取的exosomes颗粒密度组间整体差异不明显（F=0.139,P=0.063）。但是在组间两两进行比较存在差异,与对照组（0h）相比,48h组单位体积血清内exosomes的颗粒数升高明显,差异具有统计学意义（P=0.020）。随着时间进展,血清中的exosomes的颗粒数先增多后降低,在48h达到高峰。不同时间点的exosomes颗粒大小的检测,结果显示用Nanosight检测的脓毒症小鼠不同时间点血清来源的exosomes的颗粒大小平均值无明显差异（F=0.352,P=0.871）,其众数值各组之间也无明显差异（F=0.310,P=0.898）。说明外泌体的直径并没有因为外界病原体的入侵刺激而增大或变小。3.用Luminex细胞因子检测系统检测了小鼠脓毒症在不同的时间段（0h、2h、12h、24h、48h）血清及血清来源exosomes内细胞因子的水平,结果显示:不同时间点血清exosomes中的促炎因子的表达水平具有明显差异。IL-1β、TNF-α在2h达到表达高峰,IL-15在12h达到表达高峰,IL-2、IL-12、IL-17、IFN-γ均在24h达到峰值,与0h对照组比较升高明显,有显著差异。与血清中的变化比较,IL-2、IL-12、IL-17、IFN-γ 表达峰值出现了延后。抗炎因子中,IL-4、IL-10、IL-5由TH2细胞产生,具有免疫负调控作用,能够抑制炎症的发生。在本次exosomes的检测中显示,不同时间点的血清中的抗炎因子的表达水平有明显差异,其中IL-4、IL-10的水平在24h时达到峰值,与0h对照组比较升高明显,有显著差异。与血清中对比,IL-4表达峰值出现了延后。而IL-5的表达水平较低。检测的exosomes中CCL2、CCL3、CCL5、CXCL9、CXCL10等主要的趋化因子结果显示:在不同时间点的血清中的趋化因子的表达水平有明显差异,其中CCL2、CCL3的水平在12h时达到峰值,与0h对照组比较升高明显,有显著差异。CCL5、CXCL9、CXCL10的水平在24h时达到峰值,与0h对照组比较升高明显,有显著差异。与血清中相比,峰值均出现延后表达。本次检测中在不同时间点的血清中的生长因子GM-CSF的表达水平有明显差异,其水平在24h时达到峰值,与对照组比较升高明显,有显著差异,与血清中比较,表达高峰出现延迟。IL-5和VEGF在Exosomes中的表达水平较低。4.脓毒症小鼠来源的exosomes能够促进T淋巴细胞向Th亚型的分化。IL-12对于T淋巴细胞向Th1方向的分化起到关键作用。IL-4对于T淋巴细胞向Th2方向的分化起到关键作用。提取小鼠的脾脏淋巴细胞,将淋巴细胞与exosomes进行孵育,发现24h提取的exosomes能够使T淋巴细胞向Th1及Th2方向的分化增强。向Th1分化的各组间的比较差异具有统计学意义（F=4.458,P=0.014）。与空白对照组比较,24h的exosomes对于T细胞向Th1的分化明显增强,差异显著（P=0.040）。24h的exosomes与正常的exosomes相比,Th1的分化也增强,差异显著（P=0.020）。在Th2方向的分化,各组间的比较差异具有统计学意义（F=22.652,P=0.000）。与空白对照组比较,24h的exosomes对于T细胞向Th2的分化明显增强,差异显著（P=0.001）。24h的exosomes与正常的exosomes相比,Th2的分化也增强,差异显著（P=0.007）。作为排除上清污染的Csup组,其表达水平同样不高,说明exosomes的提取过程中,上清中的残留并没带来影响。以上结果说明24h提取的exosomes能够促进T淋巴细胞的分化。考虑到是否exosomes内的LPS成分起到促进作用,我们采用TLR4基因敲除小鼠的淋巴细胞进行验证。结果显示:阳性对照组LPS组其分化能力相对于DPBS组无明显差异,说明TLR4-/-小鼠来源的淋巴细胞能够消除LPS所带来的分化能力。与空白对照组比较,24h的exosomes对于T细胞向Th1的分化明显增强,差异显著（P=0.019）。同样与正常exosomes 比较,差异明显,说明24h exosomes对于TLR4敲基因小鼠淋巴细胞的分化仍具有促进作用。这说明能够排除24h exosomes中LPS所带来的的效用。Th2分化的各组间的比较差异具有统计学意义（F=12.468,P=0.001）。与空白对照组比较,24h的exosomes对于T细胞向Th2的分化明显增强,差异显著（P=0.000）,同样与正常exosomes比较,差异明显,阳性对照组LPS组可发现其相对于PBS组无明显差异。所以可以排除是由LPS所带来的分化效应的可能。5.脓毒症小鼠24h血清来源的exosomes能够促进淋巴细胞的增殖。Exosomes中包含有生长因子,检测其对淋巴细胞的增殖能力是否有影响。通过羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯染色技术（CFSE）对淋巴细胞在exosomes的作用下的增殖能力进行了检测,结果显示:exosomes对于淋巴细胞的增殖的影响,各组差异明显（F=10.756,P=0.00）。脓毒症小鼠24h血清中提取的exosomes能够明显增强淋巴细胞的增殖能力,与空白对照组比较升高明显,有显著差异（P=0.006）。与正常小鼠来源的exosomes相比,24h的exosomes对淋巴细胞的增殖作用明显,具有显著差异（P=0.02）。100ng/ml的LPS已被证实能够促进淋巴细胞的增殖,所以用LPS组作为阳性对照组,表达水平明显高于对照组（P=0.000）。而正常小鼠来源的exosomes并无明显的增强增殖能力的作用。作为排除上清污染的Csup组,其表达水平同样不高,说明exosomes的提取过程中,上清中的残留并没带来影响。24h的exosomes能够促进淋巴细胞的增殖。而为了排除LPS的干扰,我们同样用敲除TLR4基因的小鼠进行了验证,结果显示:24h的exosomes仍能够促进淋巴细胞的增殖,与空白对照组比较差异显著（P=0.049）。而阳性对照LPS组该增殖作用则消除了,说明该敲基因鼠能够消除LPS的作用,该淋巴细胞的增殖并非由LPS带来。该实验证实脓毒症小鼠血清中24h提取的exosomes能够增强淋巴细胞的增殖能力,对于增强淋巴细胞的免疫能力有重要作用。6.脓毒症小鼠24h的血清来源的exosomes能够在其所含的IL-12、IL-4的作用下促进纯化的T淋巴细胞向Th1/2亚型的分化。在本研究中,我们将T淋巴细胞纯化出来,然后检测exosomes对T细胞分化能力的影响,结果显示:当exosomes与纯化的T细胞孵育时,可以增强其向Th1亚型的分化,各组间差异明显,具有统计学意义（F=8.553,P=0.003）。脓毒症24h的exosomes对Th1的分化能力明显强于空白对照组和正常exosomes组,差异显著。（P=0.000,0.005）。Anti-IL12组为我们设置的中和对照组,Th1的分化与exosomes中的IL-12有关,将中和抗体anti-IL12与exosomes在37℃下孵育1h,然后刺激淋巴细胞,发现其向Th1亚型分化的能力与24h-exosomes组相比明显减弱,差异显著（P=0.03）。以上结果说明在exosomes内的IL-12对于T淋巴细胞向Th1亚型的分化起到作用。同样在Th2亚型的分化方面,因为IL-4在Th2的分化上扮演着关键角色,设置了 anti-IL4的对照组。发现24h-exosomess组比空白对照组分化水平明显升高,且anti-IL4对照组也有所降低。7.脓毒症血液来源的exosomes能够增强淋巴细胞的趋化能力。在体外实验细胞水平,我们通过Transwell模型对其进行了趋化实验。第一种实验方案,将exosomes直接铺入下室,观测其能否对淋巴细胞进行趋化。结果显示24h的exosomes并不能引起下室细胞数增多,各组之间差异不明显,说明没有产生对淋巴细胞的趋化吸引。接下来我们将exosomes先与淋巴细胞孵育,然后种入上室,让exosomes与淋巴细胞直接接触,下室铺同等浓度10%的血清。结果显示24h exosomess组进入下室的细胞数较空白对照组和正常exosomes组均明显增多,差异显著（P=0.045,0.043）。说明24h的exosomes能够与淋巴细胞直接反应,增强其趋化能力。该细胞实验说明exosomes能够通过与淋巴细胞直接接触,从而增强淋巴细胞的趋化能力。我们随后又进行了小鼠的体内实验,建立了小鼠的air pouch模型,该模型是通过在小鼠体内建立一囊性空腔,将刺激物注射入空腔内,一段时间后检测该刺激物趋化至空腔内的细胞数量及种类的多少来测定该刺激物的趋化能力。由于该模型在体内,更能反映真实的趋化环境。我们将脓毒症小鼠24h血清中的exosomes注射入空腔中,12h后通过流式计数其趋化的淋巴细胞数,发现其细胞数较空白对照组和正常exosomes组均明显增多,差异显著（P=0.000,0.000）。以上结果说明在脓毒症exosomes能够增强淋巴细胞的趋化能力。8.脓毒症小鼠来源的exosomes能够延长脓毒症小鼠的生存时间、降低炎性因子水平。通过尾静脉注射exosomes进入小鼠体内,然后造小鼠脓毒症模型,观察小鼠的生存时间及存活率,以证明由脓毒症小鼠24h的血清分泌的exosomes是否具有保护作用。结果显示:注射DPBS组的小鼠和0h exosomes组的小鼠的生存时间基本保持一致,而24h exosomes组的小鼠的生存时间与两个对照组比较明显提高,差异有统计学意义（P=0.002,0.026）。该实验说明注射脓毒症24h血清来源exosomes能够延长脓毒症小鼠的生存时间、提高生存率。反映脓毒症exosomes能够对于脓毒症小鼠起到保护作用,降低病变的严重程度。通过luminex检测其在注射exosomes后小鼠体内的表达水平,结果显示:24h exosomes组的TNF-α表达水平较0h exosomes组的水平低,差异显著（P=0.033）。24h exosomes组的IL-10表达水平也较0h exosomes组的水平低。两组炎性因子结果相似,都是在注射24h的exosomes后出现了水平的下降。促炎因子水平和抑炎因子水平都较注射正常exosomes的水平低,说明24h的exosomes能够改善脓毒症过程中的免疫应激状态。研究结论:1.通过差速超速离心结合超滤的方式能够将脓毒症小鼠血清中的exosomes成功提取出来,其颗粒大小均在200nm以下,众数值为91nm。脓毒症48h获得的exosomes的蛋白含量最高,颗粒数最多。Exosomes颗粒大小并没有随着脓毒症进展产生明显差异。2.脓毒症血清来源的exosomes内包含有大量的细胞因子,随着脓毒症进展其浓度产生变化,且不同的时间点细胞因子浓度的变化趋势与血清中细胞因子的变化趋势存在差异。3.脓毒症血清来源的exosomes能够借助其所含的细胞因子促进T淋巴细胞向Th1/2亚型的分化,增强淋巴细胞的增殖和趋化能力,从而起到调控炎症免疫的功能。4.脓毒症血清来源的exosomes注射入脓毒症小鼠体内可以延长小鼠存活时间、降低炎性因子水平,起到保护作用。总结:Exosomes已被证实对炎症免疫疾病具有调控作用。本研究首次从exosomes角度分析脓毒症过程中细胞因子的存在形式,发现其在血清中除了以自由的可溶性蛋白分子的形式存在外,还以exosomes结合的方式存在。在脓毒症的不同时间点,exosomes内含细胞因子浓度存在明显差异,该差异与血清中的差异不同。脓毒症exosomes与免疫细胞作用,能够通过其所含的细胞因子对免疫细胞起到调控作用。并且该exosomes能够对脓毒症小鼠起到保护作用。本研究为从exosomes角度解析和治疗脓毒症提供了新的研究策略。