【摘 要】
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目的:本研究采用四氯化碳(Tetrachloromethane,CCl4)致小鼠急性肝损伤模型,观察大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷(Physcion-8-O-β-D-monoglucoside,PMG)的保肝作用,并初步探讨其保肝作用是否通过调控肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)/磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphoinositol 3-kinase
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目的:本研究采用四氯化碳(Tetrachloromethane,CCl4)致小鼠急性肝损伤模型,观察大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷(Physcion-8-O-β-D-monoglucoside,PMG)的保肝作用,并初步探讨其保肝作用是否通过调控肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)/磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphoinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase B,AKT)信号通路,产生抗炎及抗细胞凋亡的作用,进而发挥保肝作用。本研究为进一步开发应用中药大黄提供一定的科学依据。方法:(1)模型的制备、分组及给药:将小鼠随机分为正常对照组、模型组、PMG低、中、高剂量组及联苯双酯组,小鼠按0.1 mL/10 g体质量灌胃相应药物,正常对照组和模型组灌胃0.5%CMC-Na溶液,PMG低、中、高剂量组分别灌胃10、20、40 mg/kg PMG混悬液,联苯双酯组灌胃300 mg/kg联苯双酯混悬液,2次/d,连续3 d。末次给药1 h后,除正常对照组外,其余各组均按照0.1 m L/10 g体质量腹腔注射0.5%CCl4油溶液,建立急性肝损伤小鼠模型,造模16 h后取材。(2)PMG对急性肝损伤模型小鼠的保肝作用:比色法检测小鼠血清中ALT、AST水平;HE染色法观察小鼠肝组织病理变化;Hoechst 33342染色法检测肝细胞凋亡数。(3)PMG保肝机制研究:采用免疫组化法检测小鼠肝组织中TNF-α、IL-6、ICAM-1、MCP-1、NF-κB p65蛋白表达;q RT-PCR法检测小鼠肝组织中ICAM-1及MCP-1 m RNA相对表达量;Western-Blot法检测小鼠肝组织中Caspase-3、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、IκB、p-IκB总蛋白及NF-κB p65核蛋白表达水平;流式细胞术检测小鼠肝组织中Th17细胞比例。(4)TNF过表达对PMG保肝作用及机制的影响:(1)分组与给药:将小鼠随机分为:正常对照组、模型组、PMG组、NC-AAV+PMG组、TNF-AAV+PMG组、联苯双酯组。NC-AAV+PMG组和TNF-AAV+PMG组分别于尾静脉注射空白病毒及TNF过表达腺相关病毒悬液0.1 m L/只,15 d后开始给药,2次/d,连续3 d。末次给药1 h后,除正常对照组外,其余各组均腹腔注射0.5%CCl4油溶液,建立急性肝损伤小鼠模型,造模后16 h取材。(2)指标检测:采用比色法检测小鼠血清中ALT、AST水平;Hoechst 33342染色法检测肝细胞凋亡数;q RT-PCR法检测小鼠肝组织中TNF-α、IL-6 m RNA相对表达量;Western-Blot法检测小鼠肝组织中TNF-α、IL-6、Caspase-3、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、IκB、p-IκB总蛋白及NF-κB p65核蛋白表达水平。结果:(1)PMG能明显降低急性肝损伤小鼠血清中ALT、AST水平(P<0.05或P<0.01),抑制肝细胞凋亡(P<0.01),改善肝组织病理损伤程度;(2)PMG能明显减少急性肝损伤小鼠肝组织中ICAM-1、MCP-1、TNF-α、IL-6、Caspase-3蛋白表达水平(P<0.05或P<0.01),降低ICAM-1及MCP-1基因表达(P<0.05或P<0.01),明显降低NF-κB p65入核蛋白表达水平(P<0.05或P<0.01),并能明显降低PI3K、AKT、IκB蛋白磷酸化水平(P<0.05或P<0.01),显著降低肝组织中Th17细胞比例(P<0.01);(3)TNF过表达可明显抑制PMG的保肝作用,并可明显逆转PMG抑制肝细胞凋亡、下调肝组织中TNF-α、IL-6 m RNA及蛋白表达水平、Caspase-3蛋白表达水平及降低PI3K、AKT、IκB蛋白磷酸化水平的作用(P<0.05或P<0.01),虽对PMG降低NF-κB p65核蛋白表达有所抑制,但无统计学意义(P>0.05)。结论:PMG对CCl4致小鼠急性肝损伤具有较好的保护作用,这一作用与其抑制TNF-α/PI3K/AKT信号通路,进而抑制肝脏过度炎症反应和肝细胞凋亡有关。
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