第一部分BACE2对延迟整流钾KCNB1的切割及其神经保护机制研究研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD)是神经科最常见的神经系统变性疾病,该病的发生与多种因素相关,如遗传、淀粉样p蛋白(β-amyloid, Aβ)毒性、氧化应激、炎症反应及胰岛素抵抗等。目前普遍认为老年斑(senile plaques,SP)是本病的特征性病理改变之一。由p淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein, APP)相继被β-分泌酶种-分泌酶切割后形成的产物Aβ是SP的主要组分。p-分泌酶1(p-site APP cleaving enzyme 1, BACE1)是一种跨膜的天门冬氨酸蛋白酶,其在各种组织广泛表达,尤其在脑组织中的表达水平较高。近年来,又发现了与BACE1具有同源性的p-分泌酶2(β-site APP cleaving enzyme 2, BACE2)。与BACE1不同,正常脑组织神经元中BACE2表达较低,但在AD脑组织中含量较高。研究表明,BACE2可以通过切割Ap以降低脑组织Aβ的沉积,因此增强BACE2的功能性表达可以缓解AD的病理改变。延迟整流钾电流通道KCNB1以高密度簇团形式定位于神经元胞体及近端树突。KCNB1分子由六个跨膜区、胞内N末端及C末端组成。跨膜部分的S1-S6形成四聚体,构成电压感应部位和K+离子选择性孔道。KCNB1胞内N末端和C末端包含75个丝氨酸,36个苏氨酸和13个酪氨酸残基,可以被胞内蛋白激酶和磷酸化酶修饰。而钙调蛋白酶可以去磷酸化KCNB1并可逆性的调节KCNB1的簇团样分布和功能。另外,KCNB1是氧化应激敏感通道,氧化条件可以诱导内部二硫键桥的形成,使通道蛋白寡聚化,从而导致通道失活。既往的研究证实,在老年鼠脑中KCNB1蛋白明显氧化,而在AD患者脑中,这种氧化失活更为严重。此外,KCNB1亦调控细胞凋亡,沉默KCNB1或截断KCNB1分子C末端的磷酸化位点可抑制神经元凋亡。研究目的前期研究结果表明KCNB1可能是BACE2的一个新底物。本研究旨在进一步明确BACE2切割KCNB1的氨基酸位点,并探索这种切割对KCNB1功能的影响,从而探讨其在AD发病中的可能作用。材料方法(1) KCNB1与BACE2过表达或敲除质粒共转入HEK293细胞后蛋白电泳检测BACE2对KCNB1蛋白含量的影响；(2)激光共聚焦显微镜观察BACE2对KCNB1膜表达的影响；(3)基质辅助激光解吸飞行时间质谱分析检测多肽片段的大小；在线多肽分析软件FindPept (http://web.expasy.org/findpept/)分析切割位点；(4)细胞全内反射荧光显微技术研究BACE2对KCNB1簇团样分布的影响；(5)原位末端转移酶标记染色法检测BACE2切割KCNB1后对神经元凋亡的影响；(6)细胞膜片钳研究BACE2切割KCNB1后对神经元电生理功能的影响。实验结果(1)在HEK293细胞系中,BACE2过表达可降低KCNB1蛋白水平,敲除内源性BACE2可增加KCNB1的表达；(2)免疫荧光结果示：BACE2过表达降低细胞膜表面KCNB1的荧光强度；(3)TOF-MALDI质谱分析表明BACE2可在第375位甲硫氨酸,第716位赖氨酸及第768位酪氨酸后对KCNB1进行切割：(4)氧化应激显著降低BACE2对KCNB1的切割效率；(5) BACE2在KCNB1第375位甲硫氨酸切割后使KCNB1丧失膜定位能力,而BACE2在KCNB1第716位赖氨酸及第768位酪氨酸切割后并不显著影响KCNB1的膜定位及簇团样分布；(6)电生理检测证实BACE2在KCNB1第375位甲硫氨酸切割后降低钾通道电流密度。(7)神经电生理及原位末端转移酶标记染色表明BACE2切割KCNB1后降低神经元凋亡率,发挥神经保护作用。实验结论BACE2可在第375位甲硫氨酸、第716位赖氨酸及768位酪氨酸之后切割KCNB1,切割后的KCNB1失去整流功能,与凋亡相关的钾电流也显著降低。本研究证实BACE2通过切割KCNB1发挥神经保护作用。第二部分人诱导性多潜能干细胞来源的大脑皮层神经元的分化模式研究研究背景哺乳动物的中枢神经系统大脑皮层由L1～L6六层结构组成,其发育按照“由内而外”的复杂精细顺序完成。与皮层发育有关的诸多编码基因突变都将导致大脑发育异常性疾病。由于难以取得疾病特异性的脑病理标本,目前关于本类疾病的分子病理机制研究多使用基因定点突变的鼠模型。然而,动物模型的建立不仅耗时耗力,且与实际的患病个体可能相差甚远。2006年,日本京都大学Yamanaka研究小组应用表达Oct-4,Sox-2,c-Myc及Klf4四种转录因子的逆转录病毒感染小鼠成纤维细胞后,得到在生物学性状方面与胚胎干细胞相类似的细胞,称之为诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPS cells)。自iPS细胞首次报道至今,其应用已经涉及临床及基础医学的各个领域。IpS细胞已用于心肌再生的研究,iPS细胞分化的心肌纤维具有一定的收缩性及自律性。此外,科学家已经成功诱导iPS细胞分化为胰岛p细胞,有望通过细胞移植治疗糖尿病。在肾脏研究领域,if,S细胞也被成功分化为肾小管上皮细胞,为iPS细胞来源的肾脏再生及移植提供研究基础。不仅如此,以iPS细胞为模型的神经系统疾病的分子病理研究如今是iPS细胞临床转化医学研究中最热门的领域。科学家已经成功建立了帕金森病(Parkinson’s Disease, PD),AD,脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy, SMA),运动神经元病(motor neuron disease, MND),亨廷顿舞蹈症(Huntington’s disease, HD)等疾病特异的iPS细胞系,并通过诱导iPS细胞分化为神经元以进一步阐明疾病的发病机制。疾病特异的iPS细胞来源的神经元携带突变的致病基因,表现疾病特异的病理特点,故iPS细胞技术可以弥补神经病理标本难以获取的不足。尽管疾病特异的iPS细胞已逐渐应用于神经系统疾病的发病机理研究,目前尚不清楚iPS细胞来源的大脑皮层神经元是否按照哺乳动物体内脑皮层神经元“由内而外”的顺序分化成熟。本研究通过免疫染色鉴定处于不同分化阶段的神经元类型以阐明iPS细胞来源的大脑皮层神经元的分化成熟模式。材料方法1.人iPS细胞的建立及鉴定(1)原代皮肤成纤维细胞的培养：标本来源于流产胎儿的皮肤组织,采用组织贴块法培养皮肤成纤维细胞；(2)核转染、iPS细胞克隆挑取及培养：采用核转染法将附加体质粒转染至1×106个皮肤成纤维细胞内；转染约30天后,边缘规则的iPS细胞克隆逐渐形成,挑取边缘清晰、GFP阴性克隆用于后续实验。E8培养基用于iPS细胞的培养,EDTA用于iPS细胞的传代；(3)iPS细胞的鉴定：采用PCR方法分析转染的外源基因是否插入到iPS基因组。免疫荧光染色分析iPS细胞干性标记物的表达。体外胚胎分析及体内畸胎瘤形成试验评估iPS细胞向三个胚层的分化潜能。ZiPS细胞分化为大脑皮层神经元(1)iPS细胞诱导分化为神经前体细胞(Day0～Day12)：含LDN 193189、XAV 939及SB 431542的神经元诱导培养基诱导iPS细胞向神经干细胞的分化；(2)神经前体细胞分化为大脑皮层神经元(Day13～Day80)：在第13天,用Accutase消化酶将神经前体细胞团消化为单细胞后接种到多聚赖氨酸包被的培养皿内,使用含有脑源性神经营养因子的神经元分化成熟培养基继续培养细胞约70天,最终得到分化发育成熟的大脑皮层兴奋性神经元；(3)免疫荧光染色鉴定不同分化阶段(Day12,Day35及Day80)神经元的类型；电生理记录评价神经元的分化成熟度。实验结果(1)人iPS细胞的建立及鉴定：核转染的皮肤成纤维细胞经过约30天的培养可形成iPS细胞克隆。生长克隆呈圆形,边缘清晰,折光性好,免疫染色鉴定iPS细胞表达OCT4、SOX2、Nanog, SSEA4及TRA1-60等干性标记。PCR检测证实外源基因未插入到iPS细胞基因组。核型分析示细胞染色体正常。体外胚胎分析及体内畸胎瘤形成试验证实iPS细胞具有向三个胚层分化的能力。(2)神经元诱导：iPS细胞经过12天的神经元诱导形成高表达FOXG1、PAX6、OTX1及SOX1等神经干细胞标记的神经前体细胞,并可见较多的神经花环(Neural Rosette)结构；在第35天,神经元发育分化逐渐成熟,形成位于L6及SP的TBR1+神经元,但尚不能检测到位于L5的CTIP+神经元；在第80天,位于L5-L2的皮层兴奋性神经元(L5的CTIP2+神经元,L3及L2的CUXI+或SATB2+神经元)逐渐分化成熟。对处于第35天,第55天及第80天的神经元进行动作电位检测,结果表明随着神经分化发育的不断成熟,神经元产生的动作电位逐渐增多。实验结论我们通过附加体质粒转染法建立了无外源基因整合的人iPS细胞系。所建立的iPS细胞核型正常,表达良好的干细胞标记,具有向三个胚层分化的特性。iPS细胞经过约80天的神经元诱导及分化,按照与哺乳动物体内皮层神经元相似的分化成熟模式(即“由内而外”的顺序)分化成熟为大脑皮层兴奋性神经元。iPS细胞诱导分化神经元的方法学建立为神经系统疾病的研究提供了较为理想的细胞模型。