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目的: 利用SELEX技术筛选与甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)特异性结合的寡核苷酸适配子,为建立MRSA快速诊断的新方法提供实验依据。 方法: 甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)为临床分离株,甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA),为国家标准品菌株;体外合成一个含35个核苷酸随机序列总长81nt库容量大约为1015-16的ssDNA文库;优化PCR反应条件;用生物素标记的引物扩增dsDNA,生物素链霉亲和素磁珠分离方法构建ssDNA文库;ssDNA文库先与MSSA结合,反筛除去与其结合的ssDNA,然后与MRSA结合,洗脱与其结合的ssDNA,构建次级ssDNA文库进行下一次筛选。利用PCR技术扩增每轮反筛,正筛后的ssDNA文库,PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,观察每轮筛选结果。将最后一轮筛选后得到的ssDNA用测序引物进行PCR扩增,转入JM109大肠杆菌中克隆和测序。应用DNA MAN软件和RNA structer软件对每一个适配子的保守序列和二级结构进行分析。体外合成FITC标记的适配子,利用荧光显微技术及PCR方法鉴定其与MRSA结合的特异性。 结果: 在SELEX筛选过程中,随着筛选轮数的增加,ssDNA与MRSA的特异性逐渐增强。经过20轮筛选后,随机文库中的ssDNA几乎不再与MSSA结合,而与MRSA结合的ssDNA得到了富集和进化,说明得到的寡核苷酸适配子可以特异性的与MRSA结合。将最后一轮筛选后得到的ssDNA用测序引物PCR扩增,转入JM109大肠杆菌中克隆和测序,挑选了35个克隆,成功测出30个序列,根据测序结果可发现所有的适配子的一级结构没有共同的同源序列,但可以分为8个家族:家族1含有保守序列ACCCCGACTCGGTTAATACAAAT,家族2含有保守序列 GGTTTTTT,家族3含有保守序列ACCTCG,家族4含有保守序列 AAATGG,家族5含有保守序列 TTGTGT,家族6含有保守序列GGTGGTGT,家族7含有保守序列GATTTACTT,家族8共4个保守序列。二级结构预测分析表明,适配子主要形成茎环结构,这些结构特征可能是适配子与MRSA的结构基础。人工合成7号适配子,进行特异性鉴定,结果发现能特异性结合MRSA,而不与MSSA、MRSCN、MSSCN大肠杆菌结合,说明7号适配子能特异性的与MRSA结合。 结论: 本研究建立起以MRSA为靶点的SELEX筛选的平台,获得与MRSA特异性结合的寡核苷酸适配子,为建立快速检测MRSA感染的新方法奠定了基础。