论文部分内容阅读
上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer,EOC）是女性生殖道肿瘤中常见的恶性肿瘤,在妇科恶性肿瘤中死亡率最高,其中浆液性囊腺癌是最常见的病理类型。大多数上皮性卵巢癌患者的治疗是采用肿瘤减灭术辅以术后铂类药物化疗。这虽然改善了上皮性卵巢癌患者的预后,但是上皮性卵巢癌患者总体生存率无明显改善,5年生存率只有30%左右。原发性或获得性化疗耐药是成功治疗上皮性卵巢癌的主要障碍。因此,攻克化疗耐药是上皮性卵巢癌研究的主要目标。化疗耐药的发生是由多种调控机制共同作用的结果,但是目前仍有很多潜在分子机制尚不明确。越来越多的证据表明异常的DNA甲基化是与化疗耐药相关的最常见的分子机制之一。本课题组在前期实验中通过简化甲基化测序（reduced representation bisulfite sequencing,RRBS）技术对卵巢浆液性囊腺癌化疗敏感患者癌组织及卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药患者癌组织进行全基因组甲基化水平测序及数据分析。结果显示卵巢浆液性囊腺癌化疗敏感患者和化疗耐药患者之间存在明显的基因甲基化差异,其中化疗耐药组中 MGRN1（Mahogunin Ring Finger 1）启动子区甲基化水平明显高于化疗敏感组。因此,本研究选取MGRN1进行深入研究,探索MGRN1基因启动子区异常甲基化参与卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药发生的可能机制。第一部分 MGRN1启动子区异常甲基化与卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药的关系目的:为进一步明确前期RRBS测序结果,探讨MGRN1启动子区异常甲基化与卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药的关系。方法:1.采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF Sequenom Mass ARRAY）检测卵巢浆液性囊腺癌患者癌组织MGRN1启动子区甲基化水平,分析MGRN1甲基化水平与化疗耐药之间的关系;采用RT-qPCR及免疫组织化学染色方法检测卵巢浆液性囊腺癌癌组织MGRN1 mRNA及蛋白表达水平,分析MGRN1 mRNA及蛋白表达水平与化疗耐药之间的关系;2.Spearman分析明确MGRN1异常甲基化与mRNA表达的相关性。结果:1.卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药组MGRN1启动子区甲基化水平明显高于化疗敏感组;2.卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药组中MGRN1 mRNA表达水平明显低于化疗敏感组;3.卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药组中MGRN1蛋白表达水平明显低于化疗敏感组;4.Spearman分析显示:MGRN1启动子区甲基化水平与mRNA表达水平呈负相关关系。结论:MGRN1启动子区甲基化水平与MGRN1表达呈负性调控关系,MGRN1启动子区高甲基化通过下调MGRN1表达参与了卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药的发生。第二部分 MGRN1基因在卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药过程中的作用及机制目的:为了明确MGRN1在卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药中的作用及机制,本研究将探讨MGRN1表达下调对浆液性卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响,并初步探讨敲低MGRN1表达引起卵巢癌细胞化疗耐药的机制。方法:1.通过稳定转染技术在SKOV3细胞株中敲低MGRN1的表达,用RT-qPCR和Western Bolt方法检测MGRN1表达水平;2.采用CCK-8实验和细胞凋亡实验观察MGRN1表达下调对卵巢癌细胞化疗敏感性的影响;3.采用RT-qPCR及免疫组织化学染色方法检测卵巢浆液性囊腺癌癌组织HSP70 mRNA及蛋白表达水平,分析HSP70 mRNA及蛋白表达水平与化疗耐药之间的关系;采用Spearman分析MGRN1 mRNA表达与HSP70 mRNA表达的相关性,并利用TCGA数据库对卵巢浆液性囊腺癌组织中MGRN1 mRNA表达及HSP70mRNA表达水平的相关性分析进行验证。结果:1.敲低MGRN1表达后,顺铂诱导SKOV3细胞株的细胞活力明显升高（P<0.05）,顺铂诱导SKOV3细胞株的细胞凋亡率明显下降（P<0.05）;2.卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药组中HSP70 mRNA及蛋白表达水平明显高于化疗敏感组;Spearman分析显示:MGRN1 mRNA表达水平与HSP70 mRNA表达水平呈负相关关系。联合TCGA数据库信息明确了 MGRN1与 HSP70的 mRNA水平存在显著相关性（r=-0.5,P=1E-13）。结论:下调MGRN1表达后会引起SKOV3卵巢癌细胞系顺铂敏感性下调;MGRN1可能通过调控HSP70的表达进而调节卵巢癌细胞的化疗耐药。第三部分 MGRN1启动子区异常甲基化与卵巢浆液性囊腺癌患者预后的关系目的:依据患者临床资料以及随访资料分析MGRN1启动子区异常甲基化与卵巢浆液性囊腺癌患者预后的关系。方法:1.运用Kaplan-Meier方法以及Cox回归模型方法分析MGRN1基因甲基化水平和mRNA表达水平与卵巢浆液性囊腺癌患者预后的关系;2.运用Kaplan-Meier方法分析HSP70基因mRNA表达水平与卵巢浆液性囊腺癌患者预后的关系。利用Kaplan-Meier plotter数据库对卵巢浆液性囊腺癌组织中HSP70 mRNA表达及卵巢浆液性囊腺癌患者的总生存期的相关性进行验证。结果:1.MGRN1基因启动子区高甲基化和MGRN1 mRNA低表达与卵巢浆液性囊腺癌患者预后不良有关（P<0.05）;2.MGRN1 mRNA低表达是预测患者无疾病进展生存期和总生存期的独立危险因素（HR=2.18,95%CI:1.07-4.11,P=0.028;HR=1.92,95%CI:0.99-3.79,P=0.045）;3.HSP70 mRNA低表达与卵巢浆液性囊腺癌患者预后不良有关（P<0.05）;利用Kaplan-Meier plotter数据库对卵巢浆液性囊腺癌组织中HSP70 mRNA表达及1207例卵巢浆液性囊腺癌患者的总生存期的相关性进行分析,结果发现HSP70 mRNA高表达组患者总生存期明显低于低表达组患者（P=0.013）。结论:MGRN1基因高甲基化与卵巢浆液性囊腺癌患者不良预后相关;MGRN1 mRNA低表达是预测卵巢浆液性囊腺癌患者无疾病进展生存期和总生存期的独立危险因素;MGRN1启动子区高甲基化可能是通过下调HSP70基因表达参与了卵巢浆液性囊腺癌患者不良预后的发生。综上所述,本研究首次探讨了 MGRN1启动子区异常甲基化与卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药的关系,为DNA甲基化调控基因表达参与卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药和不良预后提供了新的实验依据。MGRN1研究表明:1)卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药患者癌组织中MGRN1启动子区甲基化水平明显低于化疗敏感组;2)MGRN1基因甲基化升高导致的mRNA水平下调与卵巢浆液性囊腺癌患者不良预后相关;3)敲低MGRN1表达可下调卵巢癌细胞株对顺铂敏感性;4)下调卵巢癌细胞MGRN1表达HSP70 mRNA表达水平明显降低;5)卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药患者癌组织中HSP70 mRNA表达水平明显高于化疗敏感组;MGRN1启动子区高甲基化可能是通过上调HSP70基因表达参与了卵巢浆液性囊腺癌的不良预后和化疗耐药的发生。