背景:在颅内恶性肿瘤中,胶质瘤是占比最高的原发性肿瘤,由于胶质瘤的高度异质性,往往难以治疗。依据胶质瘤的恶性程度,胶质瘤被划分为WHO I-IV级。其中接受手术治疗和同步放化疗及TMZ维持治疗的GBM患者,统计数据显示他们的中位生存期不超过15个月,五年生存率经统计仅约为8-14%。尽管近年来胶质瘤的诊断和治疗理念不断更新,但由于胶质瘤的高度异质性特征,现有的治疗方法未能对胶质瘤患者的生存率和疾病进展产生显而易见的影响。TMZ是目前治疗GBM的一线药物,其抗胶质瘤的主要机制是TMZ造成O6位置鸟嘌呤甲基化,导致DNA双键断裂,从而诱导胶质瘤细胞发生凋亡。但由于肿瘤内各种突变分子的存在和复杂的分子通路,导致TMZ耐药现象日益突出。因此,迫切需要开发新的多靶点抗胶质瘤药物以改善患者生存率。TP53是公认的抑癌基因,p53蛋白是其转录翻译的产物,同时在全世界的癌症患者中TP53基因也是突变频率最高的基因。正常情况下,wtp53蛋白半衰期极短,非应激条件下其在体细胞内的含量保持低水平。在各种应激情况如细胞遭受DNA损伤、癌基因激活等条件下,wtp53会被翻译后修饰激活,包括磷酸化、乙酰化、甲基化等。激活后的wtp53选择性的与其靶基因结合,参与调控细胞内DNA修复、细胞周期、细胞凋亡和氧化应激等生物学过程发挥抗癌功能。然而,超过半数的癌症中存在TP53基因突变。mutp53通常会丧失抑癌功能,并与剩余存在的wtp53形成四聚体,从而阻断剩余wtp53的抑癌作用。此外,在缺乏wtp53的细胞中,mutp53往往显示出致癌活性。mutp53在细胞内很难被降解,从而在细胞内积聚,这也是mup53获得致癌功能的基础。因此,促进mutp53降解是治疗mutp53高表达肿瘤的有效手段。胶原蛋白是ECM中不可或缺的组成成分,在体内各种蛋白质中,胶原蛋白的占比最高。XI型胶原蛋白α1链（COL11A1）已被证明在多种癌症中高表达,COL11A1也被证明促进癌症恶性进展。此外,COL11A1可作为预测肿瘤预后的肿瘤标志物,但COL11A1在胶质瘤中的作用仍不清楚。COL11A1参与细胞内多个信号转导途径,包括TGF-β1、AKT、B-myb和Gli1在内的多个基因可以促进COL11A1的转录。COL11A1的高表达促进了下游相关分子如Twist1和MMP3的表达,这些分子与肿瘤的耐药性和侵袭性有关。迄今为止,仅发现少数几种药物可以抑制COL11A1的m RNA和启动子活性,从而降低COL11A1的表达。小檗碱是从多种植物中分离出的异喹啉类生物碱,在中国作为治疗细菌性腹泻的非处方药已使用多年。小檗碱也被认为是治疗高脂血症和糖尿病的潜在药物。近年来小檗碱还被证明具有抗癌功能,研究显示小檗碱主要通过调节MAPK、ERK1/2、JNK、AKT和Wnt/β-catenin信号通路发挥抗癌作用。然而,小檗碱对mutp53和COL11A1的作用仍有待研究。目的:本研究的目的是探讨小檗碱在胶质瘤细胞中对wtp53和mutp53的不同影响,以及研究COL11A1蛋白在胶质瘤细胞中的作用并阐明小檗碱抑制COL11A1的作用机制。方法:在本研究中,通过CCK-8法检测小檗碱对U87、U251和T98G胶质瘤细胞存活率的影响。接下来,选取wtp53细胞系U87细胞和mutp53细胞系U251细胞（p53 R273H）为研究对象,通过细胞克隆实验检测小檗碱对其增殖能力的影响,通过流式细胞仪分析小檗碱对wtp53和mutp53细胞系周期的影响,通过蛋白印迹法（Western blotting）检测小檗碱对wtp53和mutp53蛋白含量和磷酸化水平及下游蛋白的影响,通过慢病毒转导检测wtp53和mutp53共存情况下小檗碱抑制胶质瘤细胞增殖的作用,通过裸鼠皮下移植瘤模型检测小檗碱在体内抑制不同胶质瘤细胞生长的作用。通过中国脑胶质瘤基因组图谱计划（CGGA）数据库分析COL11A1与胶质瘤患者的生存率关系,通过Western blotting分析COL11A1在不同胶质瘤细胞系内的表达情况,选取COL11A1高表达细胞系U87和T98G细胞为研究对象,通过si RNA技术敲除胶质瘤细胞内COL11A1基因,研究COL11A1对胶质瘤细胞侵袭和耐药的影响。通过划痕实验检测小檗碱对U87和T98G细胞迁移能力的影响,通过Transwell实验检测小檗碱对U87和T98G细胞侵袭能力的影响,通过F-actin探针检测小檗碱对U87和T98G胶质瘤细胞细胞骨架的影响,通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测所选取的细胞培养上清中TGF-β1水平,通过Western blotting检测小檗碱对TGF-β1/COL11A1通路及其下游蛋白的影响,通过HE染色和免疫荧光分析小檗碱在体内对胶质瘤移植瘤内胶原及COL11A1的影响。结果:1.CCK-8结果显示小檗碱以时间依赖性和浓度依赖性方式抑制胶质瘤细胞活力。细胞克隆实验显示小檗碱抑制U87和U251细胞增殖能力。流式细胞术结果显示小檗碱诱导U87细胞周期阻滞在G1期,诱导U251细胞周期阻滞在G2期。2.Western blotting结果显示小檗碱在U87细胞中增加wtp53蛋白的磷酸化水平,促进p21蛋白表达,抑制cyclin D1蛋白在U87细胞内的表达。而在U251细胞中,小檗碱同时抑制了mutp53蛋白的表达和mutp53蛋白的磷酸化水平,抑制p21蛋白和cyclin D1的表达。3.使用慢病毒将wtp53转入U251细胞后,小檗碱对其具有更强的周期阻滞效果,HA-tag显示小檗碱对外源性wtp53含量无显著影响。4.裸鼠皮下移植瘤模型显示小檗碱显著抑制U87和U251细胞体内生长,免疫组化结果显示小檗碱在体内促进wtp53磷酸化,并减少mutp53的含量及其磷酸化水平。对裸鼠体内主要器官行HE染色后证明小檗碱对裸鼠脏器无明显损伤,证实小檗碱在体内的安全性。5.CGGA数据库分析表明COL11A1高表达的胶质瘤患者生存期明显短于COL11A1低表达的患者,两组数据相比较之后具有统计学意义。Western blotting检测七株胶质瘤细胞系内COL11A1水平,结果显示除A172细胞外,其余六株胶质瘤细胞系内COL11A1高表达。选取U87（MGMT缺陷）和T98G（MGMT表达）细胞为研究对象,通过si RNA技术敲除胶质瘤细胞内COL11A1基因后发现,胶质瘤细胞的迁移、侵袭能力显著降低,同时对TMZ更敏感。Western blotting结果显示COL11A1敲除后细胞内MMP2、MMP3、MMP9表达明显降低,MGMT和snail蛋白含量也明显降低。6.细胞划痕实验和Transwell实验表明小檗碱以剂量依赖性抑制U87和T98G两种胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力。高倍显微镜观察胶质瘤细胞形态后发现小檗碱减少胶质瘤细胞质膜褶皱的形成和突起,F-actin探针显示小檗碱改变了U87和T98G细胞内肌动蛋白骨架排列方式。Western blotting结果显示小檗碱减少胶质瘤细胞内TGF-β1、COL11A1、MMP2、MMP3、MMP9蛋白的含量。ELISA结果显示小檗碱减少了T98G细胞培养液上清中TGF-β1的水平,却对U87细胞培养液上清中TGF-β1水平无明显影响。在细胞培养液中加入TGF-β1后能部分逆转小檗碱对胶质瘤细胞迁移和侵袭的抑制作用。7.CCK-8实验和DAPI染色显示小檗碱可以增加胶质瘤细胞对TMZ的敏感性。Western blotting结果显示小檗碱在U87细胞中抑制snail蛋白的表达,在T98G细胞中抑制MGMT和snail蛋白的表达。HE结果显示小檗碱在体内改变胶质瘤细胞排列,增加细胞间空隙。免疫荧光结果显示小檗碱在体内抑制COL11A1蛋白表达。结论:1.小檗碱在体内和体外均可抑制胶质瘤细胞增殖。2.小檗碱促进wtp53磷酸化,从而促进其发挥抑癌功能;小檗碱抑制mutp53的表达及其磷酸化,抑制其致癌作用。3.COL11A1高表达与胶质瘤患者预后不良相关。4.COL11A1与胶质瘤细胞的迁移、侵袭和TMZ耐药有关。5.小檗碱通过抑制TGF-β1/COL11A1通路抑制胶质瘤细胞迁移、侵袭和TMZ耐药。