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第一部分:结肠癌患者肿瘤组织和血浆中HMGB1的表达情况目的:肿瘤恶病质是一种以体重下降,肌肉萎缩,系统炎症为主要特征的代谢性消耗性疾病。然而,目前没有有效治疗恶病质肌肉萎缩的药物。多种炎症因子被报道参与恶病质的发生发展。HMGB1是一种炎症因子,与肿瘤、炎症、免疫密切相关,HMGB1的两个受体TLR4和RAGE相继被报道参与恶病质肌肉萎缩,然而HMGB1在恶病质中的研究较少。本部分研究探索HMGB1在结肠癌患者肿瘤组织中的表达情况以及结肠癌恶病质与非恶病质患者中血浆HMGB1水平。方法:从UCSC数据库下载经过标准化的TCGA泛癌数据和GTEx正常组织表达数据,利用生物信息学分析HMGB1在泛癌水平的表达。从GEO数据库下载结肠癌数据集,进一步研究HMGB1在肿瘤组织中的表达并探索其预后意义。收集2020年5月至2020年9月于我院住院的结肠癌患者,收集患者基线资料、恶病质分期量表、ECOG体力状态评分、厌食评分、近一个月内的腹部CT图像以及患者血浆。结果:在 TCGA COAD,GSE20916,GSE21510,GSE18105,GSE39582 结肠癌数据集中发现结肠癌组织对比正常结肠组织HMGB1在mRNA水平均升高。在有预后数据的 TCGA COAD,GSE17538,GSE14333,GSE39583 数据集中 HMGB1 高低表达组预后无差异。横断面研究纳入了 104例结肠癌患者,比较结肠癌恶病质组与非恶病质组之间血浆HMGB1的水平,发现恶病质组血浆HMGB1水平明显高于非恶病质组且差异有统计学意义。随后对血浆HMGB 1与骨骼肌指数进行相关性分析,发现血浆HMGB1水平与骨骼肌指数呈负相关关系(R=-0.31,P<0.001)。结论:结肠癌组织中HMGB1在mRNA水平升高,血浆HMGB1水平在结肠癌恶病质患者中升高,血浆HMGB1与骨骼肌指数呈负相关关系。第二部分:HMGB1在细胞水平通过激活TLR4/NF-κB信号通路诱导肌管萎缩目的:前一部分的研究发现血浆HMGB1在结肠癌恶病质患者中升高并且与骨骼肌指数呈负相关,HMGB1的两个重要受体TLR4与RAGE都被报道参与骨骼肌萎缩,提示HMGB1可能参与了恶病质肌肉萎缩。为了进一步探索HMGB1在恶病质中的作用,本部分研究从细胞水平探索HMGB1对C2C12肌管萎缩的作用及相关机制。方法:提取并鉴定CT26细胞的细胞外囊泡(EVs),观察EVs对C2C12肌管细胞的作用,Western blot检测肌萎缩相关蛋白Atrogin1和MuRF1的表达。检测CT26结肠癌细胞和正常结肠上皮细胞HMGB1的水平,检测CT26 EVs中HMGB1的水平。分别用不同浓度的EVs和不同浓度的重组HMGB1处理C2C12细胞,观察肌管形态,测量肌管直径,Western blot检测肌萎缩相关蛋白Atrogin1和MuRF1的表达。用TLR4抑制剂处理HMGB1刺激的C2C12肌管细胞,Western blot检测肌萎缩相关蛋白Atrogin1和MuRF1的表达水平。使用NF-κB信号通路和MAPK信号通路抑制剂,观察其对C2C12肌管萎缩的作用以探索其可能的下游通路。然后用HMGB1抑制剂甘草甜素处理HMGB1刺激的C2C12肌管细胞,Western blot检测肌萎缩相关蛋白Atrogin1和MuRF1的表达。使用HMGB1抑制剂甘草甜素,观察其对EVs引起的肌管萎缩的影响。利用慢病毒转染构建低表达HMGB1的CT26细胞系(shHMGB1 CT26),检测该细胞EVs中HMGB1水平的变化,并观察低表达HMGB1后CT26 EVs对C2C12肌管的影响。结果:CT26 EVs可以被C2C12肌管细胞摄取,且CT26 EVs可以诱导C2C12肌管萎缩,并检测到肌萎缩相关蛋白Atrogin1和MuRF1的表达升高,说明成功构建了 EVs诱导的C2C12肌管萎缩模型。去除CT26条件培养基中EVs后,C2C12肌管萎缩缓解,证明EVs是CT26条件培养基引起C2C12肌管萎缩的因素之一。对比正常结肠上皮细胞NCM460,CT26结肠癌细胞中HMGB1水平升高,且CT26 EVs中HMGB1水平较高。一定浓度的HMGB1可以引起肌管直径减小和肌萎缩相关蛋白Atrogin1和MuRF1的升高。使用甘草甜素后,观察到HMGB1所致的肌管萎缩部分缓解且CT26 EVs引起的肌管萎缩也部分缓解。使用TLR4抑制剂后,肌萎缩相关蛋白Atrogin1和MuRF1的水平降低。使用NF-κB信号通路抑制剂可以明显降低肌萎缩相关蛋白Atrogin1和MuRF1的表达水平,HMGB1主要通过TLR4/NF-κB引起肌肉萎缩。低表达HMGB1的CT26来源的EVs引起肌管萎缩作用减弱。结论:一定浓度的HMGB1和含有HMGB1的CT26 EVs能诱导C2C12肌管萎缩,甘草甜素可以缓解HMGB1和EVs诱导的C2C12肌管萎缩,HMGB1通过激活TLR4/NF-κB信号通路引起C2C12肌管萎缩。第三部分:抑制HMGB1可以在动物水平缓解CT26荷瘤小鼠恶病质目的:上一部分研究发现HMGB1通过TLR4/NF-κB信号通路诱导C2C12肌管萎缩,通过使用HMGB1抑制剂甘草甜素可以缓解HMGB1和EVs诱导的C2C12肌管萎缩,本部分研究探索在动物水平低表达HMGB1的CT26荷瘤小鼠恶病质的情况,以及使用甘草甜素对CT26荷瘤小鼠恶病质的作用。方法:构建稳定低表达HMGB1的CT26细胞系,将6周雄性BALB/C小鼠随机分成五组,即空白对照组,CT26组,shCON CT26组,shHMGB1 CT26组和shHMGB1 CT26+CT26 EVs组,通过比较小鼠体重、去瘤体重、腓肠肌、胫骨前肌、附睾脂肪重量,评估肿瘤中的HMGB1在结肠癌恶病质中的作用。研究HMGB1抑制剂甘草甜素对CT26荷瘤小鼠的作用,将6周雄性BALB/C随机分成四组,即空白对照组,CT26组,CT26+10 mg/kg甘草甜素组和CT26+20 mg/kg甘草甜素组,皮下注射肿瘤细胞后第7天开始给药,给药14天后出组,取血浆,收集肿瘤组织、腓肠肌、附睾脂肪并称重,取部分肌肉和脂肪组织进行HE染色,比较小鼠体重,去瘤体重,腓肠肌质量,附睾脂肪质量,骨骼肌纤维横截面积和血浆炎症因子水平,研究甘草甜素对CT26荷瘤小鼠的作用。结果:动物实验中,低表达HMGB1的CT26荷瘤小鼠比正常荷瘤小鼠恶病质减轻,且注射CT26 EVs后恶病质加重。HMGB1抑制剂甘草甜素可以缓解恶病质小鼠瘦体重的下降、腓肠肌和附睾脂肪质量的降低,增加腓肠肌肌纤维的横截面积,降低血浆炎症因子TNFα和IL-6的水平,Western blot显示甘草甜素降低肌萎缩相关蛋白Atrogin1和MuRF1的表达且抑制NF-κB信号通路关键分子磷酸化p65和IκB的表达。结论:低表达HMGB1的CT26荷瘤小鼠恶病质有所缓解,HMGB1抑制剂甘草甜素能通过抑制NF-κB信号通路缓解CT26荷瘤小鼠的肌肉萎缩,延缓恶病质的进展。