死亡相关蛋白激酶(DAPK)是丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶家族的成员之一,其可被钙调蛋白调节,DAPK在多种恶性肿瘤(如肺癌,膀胱癌等)中的表达缺失常常伴随着肿瘤的转移等过程,也有研究表明DAPK的低表达与淋巴结转移有重要联系。但是DAPK对肝癌细胞的具体作用方式及其调控机制尚不明确,通过对DAPK调控肝癌细胞转移的信号通路的研究,可将DAPK做为肝癌新的治疗靶点。研究目的:本课题的研究目的在于探讨DAPK在肝癌中对DDX20的调控机制,并且通过研究DAPK介导DDX20调控肝癌细胞转移的分子机制,确定分子靶点DAPK在肝癌细胞中的重要价值。研究方法:首先使用慢病毒转染Tet-pLKO-shRNA和脂质体转染Tet-on系统的方法,分别构建了可诱导DAPK敲弱和过表达的Hep3B肝癌稳转细胞株,用于增殖和转移等功能学实验,检测DAPK蛋白表达的上升或下降对肝癌细胞增殖和转移的影响。将可诱导DAPK敲弱的Hep3B肝癌稳转细胞株用于蛋白组学实验,通过蛋白组学实验筛选出蛋白表达量受DAPK调节的DDX20蛋白,然后通过Western blot实验检测在DAPK表达量变化后DDX20蛋白表达量的变化。在DAPK敲弱或过表达后,过表达或敲弱DDX20,通过划痕实验和细胞侵袭实验检测DDX20对DAPK细胞功能学的影响。通过分析DAPK对DDX20mRNA表达量和DDX20蛋白稳定性,确定DAPK对DDX20的调控方式,确定DAPK激酶活性对DDX20稳定性的影响,通过DDX20磷酸化位点点突变实验,确定DAPK对DDX20蛋白磷酸化的影响,为DDX20作为DAPK下游调控靶点提供依据。实验结果:实验结果显示,Hep3B细胞的生长状况不会因为DAPK蛋白表达的下降而受到影响,但是Hep3B细胞的转移能力却与DAPK的表达量呈现负相关,Western blot实验发现DDX20蛋白表达量的变化与DAPK蛋白表达量的变化呈现正相关,与蛋白组学分析结果相吻合,并且DDX20可逆转DAPK对细胞迁移和侵袭的抑制。DAPK不会对DDX20的mRNA有影响,但是可以调控DDX20蛋白的稳定性,并且依赖DAPK的激酶活性,通过磷酸化位点点突变实验确定了DAPK作用于DDX20基因上的磷酸化位点。综合以上实验结果,得到的结论是DAPK能够抑制肝癌细胞的侵袭和迁移,对细胞的迁移和克隆形成没有影响,并且DAPK通过其激酶活性提高其下游蛋白DDX20的稳定性并且DDX20参与DAPK对肝癌细胞的细胞功能学调控过程。此外,DAPK可抑制肝癌细胞中Cdc42的活性,这一调控可能依赖DDX20;DAPK也可能参与DDX20对NF-κB信号通路激活因子IKK-β的调控。DDX20作为DAPK下游的调控因子,参与DAPK对肝癌细胞的转移过程的调控,并将其确定为肝癌新的治疗靶点。