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原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是常见恶性肿瘤之一,其病死率高居全球第二位。肝癌干细胞(livercancerstemcells,LCSCs)是一小群具有多向分化潜能、自我更新能力和耐药的异质细胞群体,在肝癌耐药和复发过程中发挥重要作用;肝癌发生发展与乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染密切相关。HBV基因组X基因编码的x蛋白(hepatitis B virus x protein,HBx)在HBV的复制和扩散中必不可少,其参与调节宿主细胞基因组稳定性、信号转导和细胞周期等,但在肝致癌过程中由HBx介导的细胞应激反应与肝癌干细胞之间的关系仍有待阐明。线粒体是细胞能量代谢的重要场所,其功能与数量的完整性与细胞结局息息相关;线粒体自噬是降解损伤线粒体,调节线粒体稳态的重要方式之一,但线粒体自噬在能量代谢中的作用尚有待阐明。代谢重编程指细胞在恶性转化过程中代谢模式发生改变,主要涉及到糖酵解、电子传递链、氧化磷酸化和磷酸戊糖途径等诸多方面,已作为肿瘤发生发展的标志之一。然而,线粒体自噬通路与糖酵解代谢重编程的关系、以及参与HBx蛋白介导肝癌细胞癌干性表型转归的作用及其调控机制,尚有待研究。目的:通过建立HBx表达诱导肝癌细胞癌干性表型模型,阐明HBx诱导BNIP3L依赖性线粒体自噬参与糖酵解代谢重编程,介导肝癌细胞癌干性转归;探讨BNIP3L干预对线粒体自噬、糖酵解代谢重编程和癌干性表型的影响。结果为进一步阐明HBx表达诱导肝癌细胞癌干性的调控机制、探讨预防和控制肝癌发生发展的潜在靶点提供依据。方法:(1)GEO分析:采用GEO数据库(GSE83148),分析HBV慢性感染人群肝组织和正常人群肝组织中干性相关基因、糖酵解相关基因和线粒体自噬相关基因差异水平情况,并分析线粒体自噬相关基因与糖酵解相关基因的相关性。(2)体内实验:pcDNA3.1-HA和pcDNA3.1-HA-HBX质粒转染人肝癌Huh7和MHCC-97H细胞,构建HBx表达的肝癌细胞模型。分别接种于BALB/c裸小鼠右下肢皮下,建立裸鼠移植瘤动物模型。①检测HBx对肿瘤生长的影响:每3天观察原位移植瘤的生长情况。24天后处死裸鼠,剥离移植瘤测量体积及质量后用于以下指标检测:②检测HBx对干性表型的影响:采用qRT-PCR检测干性相关基因(ABCG2,BM1,NANOG,KLF4,OCT4)转录水平;WB检测干性相关蛋白(ABCG2,Oct4,Bmi-1,CD44)表达;IHC检测组织中干性相关蛋白表达情况。③检测HBx对BNIP3L依赖性线粒体自噬的影响:WB检测总蛋白和线粒体蛋白中BNIP3L依赖性线粒体自噬相关蛋白(HIF-1 a,Beclin 1,BNIP3L,LC3B)表达;IHC检测组织中BNIP3L依赖性线粒体自噬相关蛋白表达情况。④检测HBx对糖酵解代谢重编程的影响:采用qRT-PCR检测糖酵解相关基因(SLC2A1,HHK2,PFKL,LDHA)转录水平;化学发光法检测细胞内ATP含量和乳酸分泌量。(3)体外实验:①本研究采用低侧群(side population,SP)细胞比例的人肝癌Huh7细胞株和高SP比例的人肝癌MHCC-97H细胞株,转染pcDNA3.1-HBX(1 μg/mL)构建HBx表达模型,以pcDNA3.1组为对照组,pcDNA3.1-HBX组为HBx表达组。上述两种肝癌细胞处理至终点时,采用qRT-PCR检测干性相关基因、糖酵解相关基因、电子传递链相关基因(ND4L,NDUFA4,ND2,CytB,ATP6,ATP8)以及ACTB等mRNA水平;采用 WB检测干性相关蛋白、线粒体自噬相关蛋白及HBx、Actin等蛋白表达;克隆形成实验和锚着非依赖生长实验检测细胞自我更新能力;Confocal检测BNIP3L和LC3B细胞内表达及与线粒体三者共定位情况和细胞内自噬流;透射电镜观察细胞线粒体自噬现象;流式细胞仪检测SP细胞比例和细胞葡萄糖摄取能力;化学发光法检测细胞内ATP含量和细胞外乳酸分泌量。②两种肝癌细胞瞬时转染pGEM-HBV和pGEM-HBVX null(1 μg/mL),以pGEM组为对照组,pGEM-HBV组为HBV表达组,pGEM-HBV X null组为HBV表达HBx缺失组,检测癌干性相关指标。③通过球囊培养法富集Huh7细胞中的肝癌干细胞,检测指标同HBx表达组。④采用CCCP(15 μmol/L)预处理Huh7细胞构建线粒体自噬阳性模型;采用BNIP3L小干扰RNA(siBNIP3L)(50 nmol/L)处理MHCC-97H细胞构建线粒体自噬抑制模型,检测癌干性和BNIP3L依赖性线粒体自噬相关指标。⑤两种肝癌细胞采用STF-31和2-DG处理构建糖酵解抑制模型,检测癌干性相关指标。⑥采用HBx表达Huh7细胞瞬时转染pTT5或者pTT5-9Dl 1(200 ng/mL)构建HBx敲低模型,检测癌干性、BNIP3L依赖性线粒体自噬和糖酵解代谢相关指标。结果:(1)GEO分析:筛选获得HBV感染肝组织(n=122)与正常人肝组织(n=6)的GEO数据库GSE83148,分析发现HBV感染肝组织中干性相关基因(BM1,CD44,NANOG,POU5F1),糖酵解相关基因(HK2,PFKL,ALDOA,PKM2),自噬相关基因MAP1LC33 mRNA水平显著高于正常人肝组织,且MAP1LC3B与糖酵解相关基因呈显著正相关。(2)体内实验:改造后的Huh7细胞3周成瘤体积约为2-3 cm3,肿瘤表面可见大量血管形成;改造后的MHCC-97H细胞3周成瘤体积约为0.1-0.2cm3,肿瘤表面光滑。与对照组相比,HBx表达组肿瘤体积增长较快,肿瘤质量和体积显著增加。剥离肿瘤组织检测发现,与对照组相比,HBx表达组移植瘤组织中干性相关蛋白和BNIP3L依赖性线粒体自噬相关蛋白表达显著增高,干性相关基因转录水平明显增加。与对照组相比,HBx表达组移植瘤组织中ATP含量下降,乳酸含量和糖酵解相关基因表达水平增高。(3)体外试验:首先,在人肝癌Huh7和MHCC-97H细胞中,①流式细胞仪分析显示分别存在1.25%和16.8%的SP细胞。与MP细胞相比,SP细胞中癌干性相关指标上升。②与对照组相比,HBx表达组两株肝癌细胞中癌干性指标上升,其中SP细胞比例由Huh7中的1.25%和MHCC-97H中的16.8%分别上升到1.73%和24.9%,细胞内BNIP3L依赖性线粒体自噬和糖酵解代谢增强。③与HBV表达组相比,HBV表达HBx缺失组中癌干性相关蛋白表达降低;④与亲本细胞相比,肝癌干细胞中癌干性相关指标上调,BNIP3L依赖性线粒体自噬和糖酵解代谢过程增强。其次,⑤在siBN1P3L构建的线粒体自噬抑制模型中,与HBx表达组相比,HBx+siBNMP3L组中BNIP3L依赖性线粒体自噬被抑制,癌干性表型相关指标降低并且糖酵解代谢被抑制;而在CCCP构建的线粒体自噬阳性模型中观察到了相反的现象。⑥在STF-31干预模型中,与HBx表达组相比,HBx+STF-31组中癌干性表型相关指标降低;在2-DG干预模型中也观察到同样的结果。同时与肝癌干细胞组相比,STF-31或2-DG干预组中肝癌干细胞癌干性表型相关蛋白表达降低。⑦在HBx表达Huh7细胞中,瞬时转染pTT5-9D11构建HBx敲低模型,与HBx表达组相比,HBx敲低表达组中癌干性和BNIP3L依赖性线粒体自噬相关蛋白表达降低,并且由HBx诱导的糖酵解代谢被抑制。结论:建立HBV、HBx表达和HBx敲低肝癌细胞体外试验模型和HBx表达肝癌细胞裸鼠荷瘤体内试验模型,诱导肝癌细胞发生糖酵解代谢重编程,介导肝癌细胞干性表型上调。HBx表达还可诱导肝癌细胞BNIP3L表达和线粒体转位与LC3B交互作用介导线粒体自噬并与糖酵解代谢重编程有关,靶向干预BNIP3L表达可调控HBx表达诱导的肝癌细胞糖酵解代谢重编程和癌干性表型。结果为进一步阐明HBx表达诱导肝癌细胞癌干性的调控机制、探讨预防和控制肝癌发生发展的潜在靶点提供依据。