研究背景与目的寨卡病毒（ZIKV）属于黄病毒科（Flaviviridae）)黄病毒属（Flavivirus）,是一种新现的重要蚊媒传播病毒。寨卡病毒感染与严重神经系统病变如成人格林巴利综合征和新生儿小头症密切相关。自2013-2014年大规模爆发流行后,其对全球公共卫生造成了沉重的负担,不幸的是,目前寨卡病毒的致病机制尚未完全阐明,也没有出现针对性的疫苗和抗病毒药物。而反向遗传系统是研究RNA病毒的重要方法,它可以从基因水平对RNA病毒进行修饰,从而为研究病毒的生命行为、致病机制、病毒-宿主细胞间的相互作用机制提供强有力的工具。所以构建寨卡病毒感染性克隆,是了解寨卡病毒生物学特性和致病机制必不可少的实验平台。研究方法1,构建寨卡病毒感染性克隆载体采用T7体外转录法构建寨卡病毒感染性克隆,首先将寨卡病毒ZKC2株基因组全长分成4个PCR片段进行扩增,相邻两个片段间有超过200bp的重叠序列,4个片段覆盖整个寨卡病毒基因组,其中在第一片段的上游引物引入T7启动子,利用重叠PCR的方法将片段④与HDVr（丁型肝炎核酶）进行连接。随后将T7启动子,寨卡病毒ZKC2株基因组全长,HDVr以In-Fusion同源重组的方法连入pWSK29低拷贝载体。转化至XL10超级感受态细胞。2,恢复病毒的拯救使用Q5超保真酶扩增体外转录DNA模板（包括T7启动子、ZKC2株全长、HDVr）、体外转录获得合成RNA,随后将合成的RNA电转至Vero细胞,观察细胞CPE产生情况。3,体内体外实验检测恢复病毒的毒力采用qPCR、噬斑实验测定恢复病毒滴度与生长动力学曲线、免疫荧光验证恢复病毒蛋白表达情况、使用皮下多点注射的方法将恢复病毒注射入一日龄的C57BL/6、昆明乳鼠体内。观察并测定病毒在体内体外实验情况下的毒力与稳定性。结果1.经过同源重组,将T7启动子、ZKC2株全长、HDVr成功连入pWSK29低拷贝载体,与ZKC2株相比,插入序列有6个突变位点,分别位于全长序列中的3149、3730、4015、5633、5744、7007位,前三个位点突变导致氨基酸改变,后三个突变为同义突变。2.NS2A 55-74位膜外区蛋白模拟结果显示,D62G突变可能导致α螺旋延长和β转角的形成,使结构更加稳定。经过3730位定点突变、体外转录,病毒全长RNA获得成功转录,电转至Vero细胞后细胞产生明显CPE,质粒和恢复病毒连传5代未发生突变。3.qPCR测定恢复病毒在Vero细胞上清中滴度可达1010copies/mL,噬斑实验表明恢复病毒滴度为107PFU/mL。生长动力学曲线表明体外实验中中恢复病毒与亲本病毒毒力相似。4.皮下多点注射恢复病毒至C57BL/6、昆明乳鼠后,两种乳鼠均出现下肢无力、运动缓慢、驼背、震颤、步态异常、体重降低等症状,随后全部死亡,病死率100%。濒死乳鼠的鼠脑产生了明显的组织病理学改变,病毒滴度达1010copies/g。恢复病毒对两种乳鼠造成的病程与亲本病毒相似。结论经过同源重组,成功构建了遗传稳定的寨卡病毒感染性克隆,体内体外实验表明恢复病毒的毒力与亲本病毒类似。本研究为探索寨卡病毒的生物学特性和开展致病机制研究提供了一个有效的工具。