研究背景肺癌已成为世界上众多国家肿瘤致死的首要病因,其总体发病率正逐年攀升。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)作为肺癌的主要病理类型,占所有肺癌发病率的80%以上。肺癌可以早期即发生淋巴结转移,晚期还可以发生远处器官转移,严重影响了患者的治疗和预后。多年来,人们一直致力于肺癌发生和发展的研究,意图能够早期诊断并科学治疗肺癌,从而改善肺癌患者的预后。在此期间许多基因和多种不同因素都被证实与肺癌的发生和发展密切相关,本课题拟研究的STAT3(signal transducer and activator of transcription3)基因就是其中之一。经实验证实,它与多种肿瘤的恶性生物学行为都存在密切关系,已被作为一种癌基因进行研究。另一方面,非小细胞肺癌的局部发展速度虽较小细胞肺癌慢,但是却存在微转移灶的威胁,有可能影响患者的预后。因此针对早期肺癌淋巴结微转移的检测及研究已逐渐受到重视并开展起来。现概述如下：信号转导和转录激活因子(signal transducers and activators of transcription, STATs)家族是Fu等1992年在研究干扰素(interferon, IFN)诱导基因转录时鉴定出的一个胞浆蛋白家族。它与酪氨酸磷酸化信号通路偶联,发挥转导调控作用,从而在多种生物学效应中发挥作用。在哺乳动物细胞中,目前发现的STAT家族成员包括STAT1(α/β), STAT2, STAT3(α/β/γ), STAT4, STAT5(a/b)和STAT6。它们分别由不同的基因编码。各STATs蛋白的大小相似,为750～900个氨基酸组成,它们有一定的结构和功能保守区域,包括氨基端(NH2)、DNA结合区(DBD)、卷曲螺旋区(CCD)、连接区和SH2结构区/酪氨酸激活区,而位于羧基端具有多样性的转录激活区(TAD),是决定STATs蛋白特异度的重要区域(附图1)信号转导和转录激活因子3(STAT3)蛋白是1994年Zhong等作为白细胞介素(IL)-6信号传递中的急性期反应因子(acute-phase response factor, APRF)被纯化的。自然状态下,它存在三种异构体：STAT3α、STAT3β、STAT3γ。其中STAT3α主要与细胞的增殖和转化有关；粒细胞集落刺激因子介导的细胞分化则依赖STAT3β的作用；STAT3γ是STAT3α的限制性蛋白水解产物,结构上它缺少STAT3α末端的TAD,可被看做是STAT3α的显性阴性异构体,STAT3γ通常在已分化的中性粒细胞中才会短暂表现活性。STAT3作为人体不可或缺的重要调控基因在多种组织和细胞中都能检测到,例如：大脑、心脏、肝脏、睾丸和胸腺是STAT3表达比较丰富的组织,脾脏、肺脏以及食管等也可以检测到。近年来,多项研究证实,STAT3与多种肿瘤的增殖分化、免疫逃避、血管形成及侵袭转移密切相关,已经成为肿瘤分子生物学研究的热点。STAT3蛋白被磷酸化后才会表现出生物学活性,也就是说STAT3是通过其活化形式的磷酸化STAT3(phosphorylated-STAT3,pSTAT3)蛋白起作用的。近年来,粘蛋白(mucins)作为一种与肿瘤生物学行为以及检测相关的高分子量糖蛋白(>200kD)日益受到医学界的重视。迄今已经发现了15个不同种类。MUC1粘蛋白(MUC1),是一种Ⅰ型跨膜蛋白,它在多种组织、器官中上皮细胞近管腔或腺腔面都有表达,而且在造血系统的多种细胞(T、B、树突状细胞等)中也有发现。MUC1在恶性肿瘤中的异常表达已经成为人们对恶性肿瘤诊断和检测的候选指标,经过多年研究发现,MUC1的异常表达主要表现在以下几个方面：(1)表达量明显增高,甚至可达正常量的100倍以上；(2)MUC1分子在细胞表面广泛分布,失去原先的极性分布特点；(3)分子本身结构改变。MUC1在肿瘤中的异常表达与肿瘤的增殖、转化及进展均有关系,同时它也已经被作为肿瘤微转移检测的敏感指标而受到广泛关注。已经有研究证实,通过逆转录聚合酶链反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测骨髓、血液或手术清扫淋巴结中MUC1的含量,可以作为诊断肿瘤微转移的重要手段,从而评估患者疾病复发的风险。本课题旨在通过检测手术清扫淋巴结中MUC1mRNA的表达来确定是否存在肺癌淋巴结微转移,再通过RT-PCR、Westem免疫印迹(Westem blot,WB)及免疫组化方法(Immunohistochemistry,IHC)检测肺癌组织中STAT3及pSTAT3的表达情况,研究STAT3在早期NSCLC中的表达与肺癌淋巴结微转移之间的关系,探索肺癌淋巴结微转移的机制。另外本课题第二部分拟通过免疫组化方法研究pSTAT3蛋白在肺癌组织中的表达,结合临床随访,探索pSTAT3与NSCLC患者预后之间的关系。希望能够在NSCLC患者肿瘤微转移、靶向治疗及预测和改善患者预后方面有所收获。第一部分STAT3在早期非小细胞肺癌中的表达与淋巴结微转移关系的研究目的：肺癌局部淋巴结微转移是术后肺癌复发的重要原因,关系到肺癌患者的远期预后。本文旨在探讨STAT3过度表达对早期NSCLC淋巴结微转移潜能的影响,希望能够在探索肺癌微转移机制及改善肺癌患者预后方面提供一定的理论依据。方法：收集2008年6月至2010年1月间在山东大学附属省立医院胸外科施行肺癌完全切除加系统淋巴结清扫的50例早期NSCLC患者的标本(IA期20例；IB期20例；Ⅱ期无淋巴结转移者10例),包括肺癌组织和200枚阴性淋巴结组织,并同时收集20例肺良性病变的正常肺组织及所属40枚淋巴结组织作为检测对照。应用RT-PCR法检测肺癌组织和阴性对照肺组织中STAT3mRNA的表达及所有淋巴结组织中MUC1mRNA的表达；再通过免疫组化及Western blot法检测STAT3蛋白及pSTAT3蛋白在肺癌组织及正常肺组织中的表达情况。实验数据统计,计量资料应用均数±标准差(x+s)表示,两组均数比较时采用独立样本t检验,多组均数比较采用F检验,F检验后两组之间再比较是否存在差异时使用SNK检验(q检验),计数资料应用Chi-squared (χ2)检验分析。以此分析比较STAT3基因和蛋白及pSTAT3蛋白的表达与早期NSCLC淋巴结微转移之间的相关性；应用Logistic多因素回归分析判定影响早期NSCLC淋巴结微转移潜能的独立相关危险因素。结果：RT-PCR检测所有淋巴结组织中MUC1mRNA的表达,结果发现19例肺癌患者的淋巴结组织中存在MUC1mRNA表达,从而证实存在淋巴结微转移。40枚正常淋巴结组织中均未发现MUC1mRNA表达。RT-PCR检测50例肺癌组织及20例阴性对照肺组织中STAT3mRNA的表达量,产物量(STAT3产物量的OD值/β-actin内参产物量的OD值)在肺癌及阴性对照肺组织中分别为0.8019±0.1462和0.3303±0.0236,两者表达差异有统计学意义(t′=22.105,P=0.000)。并且STAT3mRNA的表达量与肺癌淋巴结微转移密切相关(t=9.308,P=0.000); Western blot检测STAT3蛋白及pSTAT3蛋白在肺癌组织及阴性对照肺组织中的表达量,表达差异均有统计学意义,STAT3蛋白表达量分别为0.9459±0.1375和0.3887±0.0269(t’=27.370,P=0.000),pSTAT3蛋白表达量分别为0.6503±0.1510和0.2192±0.0215(t′=19.696,P=0.000)。统计结果显示,STAT3蛋白和pSTAT3蛋白的过度表达均与肺癌淋巴结微转移密切相关(P<0.05)；免疫组化方法检测结果显示,存在淋巴结微转移的肺癌组织中有18例(94.74%)STAT3蛋白及14例(73.68%)pSTAT3蛋白表达阳性,高于无淋巴结微转移肺癌组织中的阳性表达率(均为38.71%)。20例阴性对照肺组织中均未查见STAT3蛋白及pSTAT3蛋白表达。Logistic多因素回归分析判定：肺癌组织中STAT3蛋白阳性表达(OR=13.379,P=0.033)及肺癌组织分化程度(OR=0.131,P=0.016)是影响早期NSCLC患者淋巴结微转移潜能的独立危险因素。结论：存在淋巴结微转移的肺癌组织中STAT3基因和蛋白以及pSTAT3蛋白表达均明显增高；STAT3过度表达可能促进了肺癌淋巴结微转移,亦可作为预测肺癌患者淋巴结微转移潜能的调控基因。第二部分磷酸化STAT3表达与非小细胞肺癌预后相关性的临床研究目的：随着全世界范围内肺癌发病率的不断提高,关系肺癌预后的相关研究更加成为肺癌研究的热点。pSTAT3蛋白是活化形式的STAT3基因表达产物,它与肺癌生物学行为的关系一直以来被人们所重视。本文旨在通过免疫组化实验及相关随访研究探讨pSTAT3表达与NSCLC预后的相关性。方法：选取2005年3月至2006年7月间在山东大学附属省立医院胸外科施行肺癌完全切除加系统淋巴结清扫的82例NSCLC患者的标本。应用免疫组化方法检测肺癌组织标本中pSTAT3蛋白的表达情况。应用χ2检验分析影响pSTAT3蛋白表达的因素；应用Kaplan-Meier法计算患者手术后的生存率并绘制生存曲线,Log-rank检验比较pSTAT3阳性组及阴性组患者的生存差别,Cox多因素回归分析判定影响NSCLC患者预后的独立危险因素。结果：在82例肺癌组织标本中,免疫组化方法检测结果显示有49例(59.76%)存在pSTAT3蛋白过度表达。统计结果分析,pSTAT3蛋白在肺癌组织中的过度表达与肺癌N分期、TNM分期及肺癌组织分化程度有关(P<0.05),与患者的性别、年龄、肺癌T分期及肺癌组织病理学类型等因素无关(P>0.05)。术后1年、3年、5年上述82名患者的累积生存率分别为89.02%、51.22%、31.71%。Cox多因素回归分析结果显示,性别、年龄、肺癌组织病理学类型、肺癌组织分化程度及T分期均与肺癌患者预后无明显相关性(P>0.05)。患者病理学N分期、TNM分期及pSTAT3蛋白在肺癌组织中的过度表达与肺癌患者预后相关(P<0.05)。结论：pSTAT3蛋白在肺癌组织中存在过度表达,并且pSTAT3蛋白过度表达与肺癌患者预后呈负相关趋势,这说明pSTAT3蛋白过度表达可能与肺癌患者远期预后有关。