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第一部分hepaCAM基因腺病毒载体构建和鉴定目的：构建表达hepaCAM基因的重组腺病毒并在膀胱癌BIU-87细胞中鉴定。方法：以pEGFP-N2-hepaCAM质粒载体为模板，PCR扩增hepaCAM基因；将hepaCAM基因克隆到穿梭质粒pAdtrack-CMV，构建穿梭载体pAdtrack-CMV-hepaCAM；经PmeI线性化后，在含pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，筛选阳性克隆；线性化后在HEK-293细胞中包装、扩增，利用报告基因EGFP进行病毒滴度检测；实时荧光定量PCR，Western blot鉴定感染腺病毒的膀胱癌BIU-87细胞中hepaCAM基因的表达。结果：测序、酶切验证重组腺病毒载体pAdEasyI-hepaCAM构建成功；病毒滴度可达1.6×1012；荧光定量PCR、 Western blot均显示感染hepaCAM腺病毒后膀胱癌BIU-87细胞中hepaCAM基因表达增高。结论：成功构建hepaCAM腺病毒载体。第二部分5-氮杂胞嘧啶核苷通过逆转hepaCAM基因启动子甲基化抑制膀胱癌细胞增殖目的：探究去甲基化药物5-氮杂胞嘧啶核苷（5-azacytidine，azac）对hepaCAM基因甲基化的影响以及对膀胱癌细胞增殖的影响。方法：去甲基化药物azac作用三株膀胱癌细胞（T24、EJ、BIU-87），MSP检测hepaCAM基因的甲基化状态；RT-PCR检测hepaCAM和甲基转移酶（dnmt3a/3b）的mRNA表达情况；Western blot和免疫荧光检测hepaCAM和dnmt3a/3b蛋白的表达情况；流式细胞术检测细胞周期分布情况、细胞克隆形成实验、CCK-8实验检测细胞增殖情况。结果：MSP显示：膀胱癌细胞空白组hepaCAM基因存在高甲基化，而azac作用后逆转了hepaCAM基因的高甲基化；RT-PCR和Wester-blot显示：空白组，hepaCAM表达明显下调，而dnmt3a/3b表达明显增多，azac作用后下调了dnmt3a/3b而上调了hepaCAM表达；进一步免疫荧光显示，azac作用后dnmt3a/3b表达下调，结果同Western-blot一致；增殖相关实验显示：azac作用后G0/G1期细胞数量增多，与空白组相比有统计学意义（p<0.05），且明显抑制了细胞克隆的形成，抑制了细胞增殖的活力。结论：膀胱癌细胞中，hepaCAM基因启动子存在高甲基化，去甲基化药物azac作用后下调了甲基化酶dnmt3a/3b表达，从而逆转hepaCAM基因的高甲基化状态，上调hepaCAM基因的表达；并且去甲基化药物作用后抑制了膀胱癌细胞的增殖。第三部分5-氮杂胞嘧啶核苷对裸鼠膀胱癌细胞移植瘤的影响目的：体内研究5-氮杂胞嘧啶核苷对膀胱癌细胞裸鼠成瘤的影响。方法：以膀胱癌EJ细胞在裸鼠皮下接种，形成膀胱癌皮下移植瘤；2周后，将老鼠随机分为两组，一组作为空白组（blank），一组作为药物处理组(azac)；空白组注射DMSO，药物组注射去甲基化药物azac；三周后处死老鼠，留取瘤体，切片行H&E及免疫组化染色，检测hepaCAM和dnmt3a/3b表达情况。结果：以3×10~6EJ细胞接种于裸鼠皮下成功成瘤，去甲基化药物处理组肿瘤体积明显小于空白组，有统计学意义（p<0.05）；免疫组化结果显示，加药组与空白组比较，hepaCAM表达升高，dnmt3a/3b表达降低。结论：去甲基化药物azac能抑制裸鼠皮下瘤的生长，并上调hepaCAM和下调dnmt3a/3b表达。