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第一部分hepaCAM基因腺病毒载体构建和鉴定目的:构建表达hepaCAM基因的重组腺病毒并在膀胱癌BIU-87细胞中鉴定。方法:以pEGFP-N2-hepaCAM质粒载体为模板,PCR扩增hepaCAM基因;将hepaCAM基因克隆到穿梭质粒pAdtrack-CMV,构建穿梭载体pAdtrack-CMV-hepaCAM;经PmeI线性化后,在含pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,筛选阳性克隆;线性化后在HEK-293细胞中包装、扩增,利用报告基因EGFP进行病毒滴度检测;实时荧光定量PCR,Western blot鉴定感染腺病毒的膀胱癌BIU-87细胞中hepaCAM基因的表达。结果:测序、酶切验证重组腺病毒载体pAdEasyI-hepaCAM构建成功;病毒滴度可达1.6×1012;荧光定量PCR、 Western blot均显示感染hepaCAM腺病毒后膀胱癌BIU-87细胞中hepaCAM基因表达增高。结论:成功构建hepaCAM腺病毒载体。第二部分5-氮杂胞嘧啶核苷通过逆转hepaCAM基因启动子甲基化抑制膀胱癌细胞增殖目的:探究去甲基化药物5-氮杂胞嘧啶核苷(5-azacytidine,azac)对hepaCAM基因甲基化的影响以及对膀胱癌细胞增殖的影响。方法:去甲基化药物azac作用三株膀胱癌细胞(T24、EJ、BIU-87),MSP检测hepaCAM基因的甲基化状态;RT-PCR检测hepaCAM和甲基转移酶(dnmt3a/3b)的mRNA表达情况;Western blot和免疫荧光检测hepaCAM和dnmt3a/3b蛋白的表达情况;流式细胞术检测细胞周期分布情况、细胞克隆形成实验、CCK-8实验检测细胞增殖情况。结果:MSP显示:膀胱癌细胞空白组hepaCAM基因存在高甲基化,而azac作用后逆转了hepaCAM基因的高甲基化;RT-PCR和Wester-blot显示:空白组,hepaCAM表达明显下调,而dnmt3a/3b表达明显增多,azac作用后下调了dnmt3a/3b而上调了hepaCAM表达;进一步免疫荧光显示,azac作用后dnmt3a/3b表达下调,结果同Western-blot一致;增殖相关实验显示:azac作用后G0/G1期细胞数量增多,与空白组相比有统计学意义(p<0.05),且明显抑制了细胞克隆的形成,抑制了细胞增殖的活力。结论:膀胱癌细胞中,hepaCAM基因启动子存在高甲基化,去甲基化药物azac作用后下调了甲基化酶dnmt3a/3b表达,从而逆转hepaCAM基因的高甲基化状态,上调hepaCAM基因的表达;并且去甲基化药物作用后抑制了膀胱癌细胞的增殖。第三部分5-氮杂胞嘧啶核苷对裸鼠膀胱癌细胞移植瘤的影响目的:体内研究5-氮杂胞嘧啶核苷对膀胱癌细胞裸鼠成瘤的影响。方法:以膀胱癌EJ细胞在裸鼠皮下接种,形成膀胱癌皮下移植瘤;2周后,将老鼠随机分为两组,一组作为空白组(blank),一组作为药物处理组(azac);空白组注射DMSO,药物组注射去甲基化药物azac;三周后处死老鼠,留取瘤体,切片行H&E及免疫组化染色,检测hepaCAM和dnmt3a/3b表达情况。结果:以3×10~6EJ细胞接种于裸鼠皮下成功成瘤,去甲基化药物处理组肿瘤体积明显小于空白组,有统计学意义(p<0.05);免疫组化结果显示,加药组与空白组比较,hepaCAM表达升高,dnmt3a/3b表达降低。结论:去甲基化药物azac能抑制裸鼠皮下瘤的生长,并上调hepaCAM和下调dnmt3a/3b表达。