论文部分内容阅读
疟疾是由疟原虫引起的严重危害人类生命安全的一种寄生虫病。与艾滋病、结核病一起被列为全球三大公共卫生问题[1]。根据世界卫生组织报告,2013年全球97个国家和地区有疟疾流行,共32亿人口受到疟疾感染的威胁,约有1.98亿疟疾患者,因疟疾死亡的人数高达58.4万,其中82%的疟疾病例及90%的死亡病例发生在非洲[2]。自上世纪40年代氯喹等抗疟疾药物问世以来,药物治疗在疟疾防治中发挥了巨大的作用。然而,随着药物长期、广泛的使用,疟原虫对抗疟药逐步产生耐药,目前恶性疟原虫几乎对所有常用抗疟药均产生了不同程度的耐药[2]。疟原虫对抗疟药物抗性的产生和发展,不仅威胁疟疾患者的生命,而且严重影响疟疾控制和消除的进程。疟原虫对抗疟药物抗性的检测不仅有助于选择合适的抗疟药物,挽救疟疾患者的的生命,而且对指导国家抗疟药物使用政策的调整具有重要意义。目前,疟原虫对抗疟药物敏感性的检测方法主要包括体内试验、体外药物敏感性检测试验和抗性靶分子检测三类。虽然体内试验是评估耐药性的产生及治疗失败的金标准,但由于其观察时间较长,且易受宿主依从性、免疫力及药代动力学等的影响[3-4]。本研究采用体外药物敏感性检测试验及抗性分子标记检测两种方法,对江苏省2012-2014年间境外输入性恶性疟原虫样本进行常用抗疟药(氯喹、甲氟喹和哌喹)的药物敏感性检测,并对境外输入性恶性疟原虫抗性靶基因(Pfcrt和Pfmdr)的多态性进行分析,为后续江苏省境外输入性恶性疟治疗药物的选择、疟原虫抗性监测方案的制定与调整提供科学依据。本研究主要包括以下三个部分:第一部分恶性疟原虫体外药物敏感性检测方法的比较和样本检测目的:1比较微量测试法(WHO microtest)、疟原虫乳酸脱氢酶(Plasmodial lactate dehydrogenase,pLDH)ELISA测定法、富组蛋白Ⅱ(Histidine-rich proteinⅡ,HRPⅡ)ELISA测定法和SYBR GreenⅠ荧光测定法等4种疟原虫体外药敏检测方法,选择一种较为稳定、简便快速且经济的体外药敏检测方法,用于境外输入性恶性疟原虫药物敏感性的监测;2采用优选的体外药敏检测方法对境外输入性恶性疟原虫样本进行氯喹、甲氟喹和哌喹的敏感性检测。方法:1以恶性疟原虫实验室虫株3D7、K1、Dd2为样本,分别采用WHO microtest法、pLDH法、HRPⅡ法和SYBR GreenⅠ法等4种体外药物敏感性测定方法检测其对氯喹和哌喹等抗疟药的敏感性,并采用Friedman检验、偏相关分析、Pearson相关分析对4种药敏检测方法的IC50值进行比较分析;2对现场采集的恶性疟原虫样本进行体外短期培养,当原虫环状体密度>2%时,进行同步化处理后,用方法1中选择的适宜体外药敏测定方法对现场虫株进行药物敏感性测定,并采用GraphPad Prism 6.0软件进行计算半数抑制量IC50值;采用SPSS 16.0软件进行正态分布检验、方差齐性检验、t检验(t,检验)和卡方检验(Fisher精确概率法)分析。结果:1在初始密度约为0.5%1%时,4种方法的IC50值之间的差异无统计学意义(P>0.05),任意2种方法间均呈直线相关关系(P<0.001)。WHO microtest法技术要求高、耗时长且结果判定受主观影响;HRPⅡ法的敏感性高于pLDH法和SYBR GreenⅠ法,但成本高;SYBR GreenⅠ法技术要求低、耗时短且成本低。2江苏省境外输入性恶性疟原虫对氯喹、甲氟喹和哌喹的抗性率分别为52.8%、47.2%和47.2%,且氯喹与哌喹间存在交叉抗性的现象。结论:1四种体外药敏检测方法均可用于恶性疟原虫的药物敏感性检测,SYBR GreenⅠ法更简便、快速且成本较低,更适用于我国疟疾消除阶段疟原虫药物敏感性检测;2境外输入性恶性疟原虫对氯喹、甲氟喹和哌喹均产生了一定程度的抗性,且氯喹与哌喹间存在交叉抗性关系。第二部分恶性疟原虫Pfcrt基因多态性与体外药敏检测的相关性目的:了解江苏省2012-2014年境外输入性恶性疟原虫Pfcrt基因的多态性并比较其与体外药敏检测结果的相关性。方法:1采用PCR-测序方法检测恶性疟原虫Pfcrt基因第72-76位及220位点基因多态性;2采用SYBR GreenⅠ方法测定恶性疟原虫样本对氯喹、甲氟喹和哌喹的敏感性;3分析Pfcrt基因多态性与对其氯喹、甲氟喹和哌喹的敏感性间的相关性。结果:1测序结果发现294例江苏省境外输入性恶性疟原虫样本Pfcrt基因的第72、74、75、76、220位点氨基酸存在突变,突变率分别为0.3%、41.5%、41.5%、41.5%及42.2%;2在氯喹停用前Pfcrt基因76位点突变率呈上升或维持在较高水平,但停用后,整体突变率则呈下降趋势。3 Pfcrt基因76位氨基酸突变与氯喹抗性具有相关性。结论:1 Pfcrt基因76位氨基酸突变与氯喹抗性具有相关性,该位点可作为氯喹抗性检测的分子标记;2随着氯喹的停用,恶性疟原虫Pfcrt基因76位点氨基酸的突变率呈现下降趋势。第三部分恶性疟原虫Pfmdr1基因多态性与体外药敏检测的相关性目的:了解江苏省2012-2014年境外输入性恶性疟原虫Pfmdr1基因的多态性及与体外药敏检测结果的相关性。方法:1采用PCR-测序的方法检测恶性疟原虫Pfmdr1基因第86位、184位、1034位、1042位和1246位氨基酸的多态性;采用荧光定量PCR法检测Pfmdr1基因拷贝数;2采用SYBR GreenⅠ方法测定恶性疟原虫对氯喹、甲氟喹和哌喹的敏感性;3分析Pfmdr1基因多态性与对氯喹、甲氟喹和哌喹的敏感性间的相关关系。结果:1测序结果发现294例江苏省境外输入性恶性疟原虫样本pfmdr1基因86、184和1246位点的氨基酸存在突变,突变率分别为31%、62.9%及5.2%;294例恶性疟原虫样本中,61.3%的样本为单拷贝数;2 Pfmdr1基因86位氨基酸变异与甲氟喹抗性相关,而Pfmdr1基因拷贝数的增加与甲氟喹和氯喹抗性相关。结论:1 Pfmdr1基因拷贝数的增加与甲氟喹抗性相关,可作为甲氟喹抗性检测的分子标记;2 Pfmdr1基因86位点氨基酸突变与甲氟喹抗性呈负相关关系;Pfmdr1基因拷贝数的增加与氯喹抗性也呈负相关关系。