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随着工业的发展,有机化合物的种类和产量与日俱增,各种生产和生活污水未达到国家排放标准就直接进入水体,饮用水水源遭到污染,严重影响居民饮水健康。有研究表明,饮用水源水中有机污染物中有一些化合物具有类雌激素作用,属于环境内分泌干扰物,能够干扰人类和动物内分泌与生殖系统的正常功能。鉴于此,本实验首先对江苏省饮用水源水中有机污染物生殖毒性进行了评估,然后,运用蛋白质组学技术,研究了饮用水源水重要有机污染物壬基酚对睾丸支持细胞的影响,筛选有机污染物雄性生殖毒性敏感标志物,为客观评价水体中有机污染物的生殖健康风险提供科学依据。
第一部分：江苏省饮用水源水中有机污染物对雄性大鼠生殖功能的影响。
目的：从江苏省29个采样点位采集饮用水源水,经过初步筛选后,探讨水样中有机污染物对大鼠睾丸支持细胞、生精细胞和间质细胞的毒性影响。
方法：⑴水样中有机提取物处理原代培养的大鼠睾丸生精细胞和间质细胞,MTT法检测生精细胞活力,放射免疫法检测间质细胞睾酮分泌水平,根据以上实验结果,筛选出生殖毒性较大的点位水样。⑵以筛选后水样中不同浓缩倍数的有机提取物处理原代培养的大鼠睾丸支持细胞、生精细胞和间质细胞,FDA-PI染色检测细胞膜完整性,MTT、CCK-8检测细胞活力,放射免疫法检测间质细胞睾酮分泌水平。
结果：①江苏省29个采样点位的饮用水源水中,筛选出18个点位的水样对大鼠睾丸生精细胞和间质细胞具有较强的生殖毒性。②对于经过筛选得到的18处饮用水源水,其对大鼠睾丸内支持细胞、生精细胞和间质细胞的毒性作用表现出很大的一致性,具体如下:浓缩50倍后染毒细胞,基本未见明显的细胞毒性作用;浓缩100倍后染毒细胞,连云港、无锡等四处水样对支持细胞造成明显的毒性损伤,连云港、无锡等五处水样对生精细胞造成明显的毒性损伤,而间质细胞较为敏感,连云港、无锡等八处水样对间质细胞造成明显的毒性损伤;浓缩200倍后染毒细胞,连云港、无锡等七处水样对支持细胞和生精细胞表现出明显的毒性作用,间质细胞同样表现的更加敏感,连云港、无锡等十二处水样对间质细胞造成明显的毒性损伤。
结论：⑴江苏省多处饮用水源水中有机污染物经富集浓缩100倍以上,即可对支持细胞、生精细胞和间质细胞产生明显的细胞毒性作用,同时显著抑制间质细胞分泌睾酮的功能,影响精子发生。⑵江苏省饮用水源水有机污染情况严重,有机污染物长期在人体内蓄积,具有潜在的生殖健康风险。
第二部分：壬基酚对大鼠睾丸支持细胞影响的蛋白质组学分析。
目的：检测有机污染物中壬基酚对支持细胞活力的影响,并运用蛋白质组学技术,检测壬基酚作用后支持细胞蛋白质谱的改变,鉴定并筛选出壬基酚雄性生殖损伤特异性蛋白作为毒性预测和安全评价的生物标志物,为饮用水水源有机污染物生殖毒性的早期预警提供依据。
方法：⑴原代培养的大鼠睾丸支持细胞经不同浓度壬基酚作用后,采用CCK-8试剂检测细胞活力变化,Annexin V和PI双染检测细胞凋亡比例。⑵运用蛋白质组学技术,检测壬基酚作用后支持细胞蛋白质谱的改变,筛选出壬基酚诱导支持细胞凋亡的敏感指标。⑶壬基酚作用支持细胞后,使用Western blot方法检测凋亡相关蛋白RKIP、ANXA7、ERp57和PRDX6的表达,验证蛋白质组学的实验结果。
结果：①CCK-8检测结果显示：10μM和20μM壬基酚作用支持细胞后,细胞活力显著降低。流式细胞检测显示：20μM壬基酚作用支持细胞后,细胞凋亡比例增加。②蛋白质组学研究结果表明：壬基酚对支持细胞的蛋白表达有显著影响。壬基酚作用24h后,共有63个蛋白点的表达丰度显著改变(P＜0.05),鉴定出41个差异蛋白点,其中18个蛋白点的表达丰度和对照组相比显著上调:23个蛋白点的表达丰度和对照组相比显著下调；壬基酚作用24h后,RKIP、ANXA7、ERp57和PRDX6的表达丰度显著改变。具体而言,0.01μM壬基酚作用24h后,RKIP表达丰度显著增加,ANXA7表达丰度显著减少,而0.1μM壬基酚作用24h后,RKIP、ERp57和PRDX6的表达丰度均显著增加,ANXA7表达丰度显著减少。③Western blot验证实验结果显示:0.01μM壬基酚作用24h后,RKIP表达显著增加,ANXA7表达显著减少,而0.1μM壬基酚作用24h后,RKIP、ERp57和PRDX6的表达均显著增加,ANXA7表达显著减少,结果与蛋白质组学分析一致。
结论：⑴10μM和20μM壬基酚能显著抑制大鼠睾丸支持细胞的活力,20μM壬基酚能诱导支持细胞发生凋亡。环境浓度壬基酚未引起明显的细胞毒性损伤。⑵壬基酚显著影响支持细胞内的蛋白质表达。在表达显著改变的蛋白中,RKIP、ANXA7、ERp57和PRDX6与细胞凋亡有关。RKIP的上调和ANXA7的下调提示环境浓度的壬基酚引起支持细胞出现轻微的凋亡趋势,而ERp57和PRDX6的上调则反映出支持细胞的一种应激保护机制。氧化应激和Ca2+的动态平衡在此过程中可能起重要作用。环境浓度壬基酚具有潜在的生殖毒性。