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研究目的:本实验通过研究HBV转基因小鼠肝脏i NKT细胞PD-1/PD-L1信号通路,从细胞分子水平探讨软肝饮在治疗HBV转基因小鼠中的免疫活性作用,揭示PD-1/PD-L1信号通路是软肝饮参与调控CHB作用的分子靶点之一,为临床应用软肝饮治疗CHB提供理论依据。研究方法:将20只HBV转基因小鼠随机均分为两组:空白血清组、含药血清组。分别予以生理盐水和中药软肝饮药液灌胃,末次灌胃1.5h后对小鼠摘眼球采血收集软肝饮含药血清。通过MTT法检测软肝饮最佳干预浓度和干预时间。向体外分离制备的HBV转基因小鼠肝脏i NKT细胞中转染PD-1特异si RNA沉默PD-1基因。给予部分小鼠i NKT细胞适宜浓度软肝饮含药血清干预后,将培养基中的细胞分成4个处理组:空白对照组、si RNA转染PD-1组、软肝饮组、si RNA转染PD-1+软肝饮组。用免疫荧光法检测i NKT细胞表面PD-1、PD-L1的表达,实时荧光定量PCR（q RT-PCR）法检测i NKT细胞PD-1、PD-L1、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的m RNA的表达,蛋白质免疫印迹法（Western Blot）法检测i NKT细胞PD-1、PD-L1、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的蛋白的表达。研究结果:1、在MTT法检测软肝饮最佳干预浓度和干预时间中:作用时间相同的情况下,10%浓度含药血清比2.5%、5%、15%、20%浓度含药血清对HBV转基因小鼠i NKT细胞的增殖能力更强;25%、30%浓度含药血清对i NKT细胞有毒性抑制作用。给药浓度相同的情况下,作用24h比作用48h、72h后的细胞活力更强。因此选择10%含软肝饮血清作用24h用于后续实验。2、在免疫荧光法测HBV转基因小鼠肝脏i NKT细胞表面PD-1、PD-L1的表达中:（1）与空白对照组相比,si RNA转染PD-1组、软肝饮组、si RNA转染PD-1+软肝饮组小鼠肝脏i NKT细胞表面PD-1荧光减弱,表达下调;软肝饮组、si RNA转染PD-1+软肝饮组小鼠肝脏i NKT细胞表面PD-1荧光微弱,PD-1显著下调。（2）与空白对照组相比,si RNA转染PD-1组、软肝饮组、si RNA转染PD-1+软肝饮组小鼠肝脏i NKT细胞表面PD-L1表达无明显变化。3、在q RT-PCR法检测小鼠i NKT细胞PD-1、PD-L1、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的m RNA的表达中:（1）与空白对照组相比,si RNA转染PD-1组、软肝饮组、si RNA转染PD-1+软肝饮组小鼠肝脏i NKT细胞PD-1的m RNA表达均显著下调（P＜0.01）;si RNA转染PD-1+软肝饮组与si RNA转染PD-1组、软肝饮组相比,HBV转基因小鼠肝脏i NKT细胞PD-1的m RNA表达有一定的下调,差异有统计学意义（P＜0.05）。（2）与空白对照组相比,si RNA转染PD-1组、软肝饮组、si RNA转染PD-1+软肝饮组HBV转基因小鼠肝脏i NKT细胞PD-L1的m RNA表达无明显变化（P＞0.05）。（3）与空白对照组相比,si RNA转染PD-1组、软肝饮组HBV转基因小鼠肝脏i NKT细胞IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的m RNA表达有一定上调,差异有统计学意义（P＜0.05）,si RNA转染PD-1+软肝饮组小鼠肝脏i NKT细胞IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的m RNA显著表达（P＜0.01）;si RNA转染PD-1+软肝饮组与si RNA转染PD-1组、软肝饮组相比HBV转基因小鼠肝脏i NKT细胞表面IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的m RNA表达有一定的上调,差异有统计学意义（P＜0.05）。4、在Western Blot法检测小鼠i NKT细胞PD-1、PD-L1、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的蛋白的表达中:（1）与空白对照组相比,si RNA转染PD-1组、软肝饮组HBV转基因小鼠肝脏i NKT细胞PD-1蛋白表达降低,有一定差异性（P＜0.05）,si RNA转染PD-1+软肝饮组小鼠肝脏i NKT细胞PD-1蛋白显著降低,差异有统计学意义（P＜0.01）;si RNA转染PD-1+软肝饮组与si RNA转染PD-1组、软肝饮组相比,小鼠肝脏i NKT细胞PD-1蛋白表达有一定降低,有统计学意义（P＜0.05）。（2）与空白对照组相比,si RNA转染PD-1组、软肝饮组、si RNA转染PD-1+软肝饮组HBV转基因小鼠肝脏i NKT细胞PD-L1蛋白表达无明显变化,差异无统计学意义（P＞0.05）。（3）与空白对照组相比,si RNA转染PD-1组、软肝饮组、si RNA转染PD-1+软肝饮组HBV转基因小鼠肝脏i NKT细胞IL-2、IL-4、IFN-γ蛋白表达均显著升高（P＜0.01）,小鼠肝脏i NKT细胞IL-10蛋白表达有一定的升高,差异有统计学意义（P＜0.05）;si RNA转染PD-1+软肝饮组与si RNA转染PD-1组、软肝饮组相比,小鼠肝脏i NKT细胞IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ蛋白表达升高,有统计学意义（P＜0.05）。结论:1、中药软肝饮通过激活i NKT细胞,调控IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ等细胞因子分泌发挥抗HBV作用。2、PD-1/PD-L1信号通路是中药软肝饮抗HBV作用的潜在分子靶点之一。3、中药软肝饮治疗CHB的机制可能与阻断PD-1/PD-L1信号通路,抑制PD-1表达,增强i NKT细胞功能有关。