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近年来研究表明，肿瘤的发生与G1／S、G2／M检查点(checkpoint)失控，使原来有遗传缺陷的细胞选择性无限制性增殖有关。G1／S检查点与p16基因有密切关系，P16蛋白是CDK4／6的抑制剂，同CyclinD1竞争与CDK4／6结合，发挥负性调节作用，共同完成对细胞增殖周期的调控。真核基因转录需要基因上游序列的顺式调控元件识别、结合转录因子，发挥调节作用，基质相关区域(matrix attached regions MARs)作为一种新型的顺式调控元件，日益受到人们的重视。MAR是核基质蛋白的作用位点，它结合在核基质上，限制DNA环。核基质是细胞核内的精细网架体系，参与DNA复制、RNA转录与加郑州人学2002 M研究主毕业论义pl6基因上游序列与胃癌细胞核基质的相关性工，并与肿瘤发生密切相关。核基质蛋白与肿瘤相关基因转录表达的相关性分析是目前肿瘤研究的新领域。 以往对… 基因的研究多集中在结构基因的改变和表达异常方面，核基质的异常与P16基因，尤其是与… 基因上游序列调控作用的相关性分析目前尚报道甚少。本研究采用十二烷基磺酸钠－聚丙烯酚胺凝胶电泳uDS干AGE）探讨核基质蛋白在胃癌中的改变；采用 Southwestern blot技术探讨…6基因上游序列－869hP中是否含有基质相关区域（。atrix attachedregions，MARs人 以及n16基因上游序列与胃癌细胞核基质的才关性。 万法：p16 promoter－luc－pGLZ－Basic主告基因表达质粒上用 EcoR和 Hindlll双酶切，提取 890hp 片段（包含 p16基因外显于 la上游E 片段人 采用地高辛随机引物法标记探针，应用DNA斑点杂交法检测探针的灵敏度。22例新鲜胃癌手术标本，含相应的癌组织、癌旁组织及正常组织。其中高中分化1＊但，＊ 分化1＊仔：卜11期9例门1且W期1＊仔。经蔗糖梯度离心得到细胞核后，低盐、高盐缓冲液提取得到核基质，并收集提取过程中溶解的可溶性蛋白质。核基质分成2份，1份经SDS－PAGE分析胃癌细胞核基质，另1份经SDS－PAGE后， 2 郑州人学2002 M研究生毕业论文 一6刹圳：游序列勺胃癌细胞核基质的相关件 电转移至硝酸纤维素膜上，标记探针与核基质进行DNA－蛋白质 结合检狈（Southwestern blot）。提取过程中低 盐、高盐缓 冲液溶解的可溶性蛋白质经SDS干AGE后，与核基质蛋自进行 比较。蛋自质电泳条带和杂交条带采用Genetoo＊软件进行 分析，结果采用秩和检验进行统计分析。一 结果显示： 1．地高辛随机引物法标记的探针灵敏度达 lgg／ul，特异 性高，符合实验要求。 2．经蔗糖梯度离心后得到的细胞核无胞浆污染。 3．SDS干AGE结果：细胞核经低盐、高盐缓冲液提取过程中 溶解的可溶性蛋白质多集中在 43KDa以下，尤其在 15亿0KDa 范围内。核基质蛋白电泳发现细胞核基质蛋白成分复杂，电泳 条带较多。应用秩和检验分别发现胃癌组织30、28KD条带变 浅，且与正常组织相比差异皆有统计学意义计州．05X 高中一 分化与低分化胃癌组织中，此二条带差异无统计学意义D （＊0．05）：工11期和111－W期相 b 差异无统计学意义 （P＞0．05）。 4·Southwestern blot结果显示正常组织主带位于 28、 30、40、43、50KD，癌组织主带位于 40、66KD处，40KD在癌 3郑州人学2002 f研穴生毕业论义pl6基冈上游序列与胃癌绷胞核乐质的扣关性和正常组织区别不大，其它条带明显减弱。应用秩和检验发现癌组织66KD 明显，与正常组织相比差异有统计学意义 u州．05人 高中分化与低分化癌组织相比差异无统计学意义 （P＞0．05八 I－11期与＊－IV期相比差异无统计学意义 （P＞0．05）。 ． 结论： 1．胃癌细胞核基质30、28KD蛋白表达量减少，与正常组织相比差异有统计学意义，高中分化和低分化胃癌差异无统计学意义，I刁期和11卜IV期肿瘤差异无统计学意义，提示胃癌核基质的改变可能在肿瘤的早期己经发生，是胃癌的早期分于事件。 2．P16基因外显子 IQ 上游－869hP片段上存在MAR序歹，提示此段 DNA对 pl6基因表达调控具有重要意义。 3．P16基因外显于IQ上游十 片段与正常组织中核基质蛋白结合主带位于 28。30、40、43、50KD处，癌组织中主