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细菌性疾病是困扰家禽养殖业健康发展的重大问题,LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的重要组成部分,可经血液或门静脉侵入肝脏引起损伤。肝损伤会严重影响家禽生理功能,导致生产性能下降甚至死亡。程序性坏死是一种既受信号分子调控又具有坏死样形态特征的新型细胞死亡方式,在肝损伤中扮演重要角色,能触发严重的氧化应激和炎症反应。LPS可激活TRIF/RIPK3/MLKL程序性坏死信号通路,该通路关键步骤是TRIF招募其下游RIPK3形成坏死小体复合物,进一步募集并磷酸化下游MLKL,活化的MLKL破坏细胞膜导致细胞死亡,所以TRIF、RIPK3和MLKL是检测程序性坏死的生物标志物。二氢杨梅素（Dihydromyricetin,DHM）是一种类黄酮化合物,具有抗氧化、抗炎、保肝等多种药理活性,在畜牧业中具有潜在的应用价值。目前,针对DHM干预家禽肝损伤中程序性坏死的研究尚未见报道。因此,本课题以雏鸡和鸡原代肝细胞为研究对象,探究DHM对LPS致鸡肝损伤的保护作用,并在此基础上明确DHM能否通过干预TRIF/RIPK3/MLKL程序性坏死信号通路缓解LPS诱导的鸡肝损伤,为DHM在兽医临床上的开发利用提供科学依据。试验内容和结果如下:（1）DHM对LPS诱导鸡肝脏损伤的保护作用:复制鸡体内肝损伤模型,设置对照组、模型组、LPS+DHM组和DHM组。应用透射电镜观察肝脏超微结构;全自动生化分析仪检测血清ALT、AST和LDH活性;试剂盒检测肝脏抗氧化酶CAT、SOD、GSH-Px活性及MDA、GSH含量;实时荧光定量PCR法检测肝脏炎症因子IL-1β、IL-6及程序性坏死相关因子TRIF、RIPK3、MLKL m RNA的表达水平;Western blot法检测肝脏TRIF、RIPK3蛋白表达及MLKL蛋白磷酸化的水平。透射电镜观察结果显示,模型组肝细胞膜破裂,细胞核形状不规则,线粒体肿胀甚至空泡化,表现出典型细胞坏死形态特征,而LPS+DHM组肝细胞结构基本正常。与对照组相比,模型组ALT、AST和LDH活性极显著升高（p＜0.01）;TRIF、RIPK3、MLKL的表达及MLKL蛋白磷酸化水平极显著升高（p＜0.01）,表明LPS引起程序性坏死;IL-1β和IL-6的表达极显著升高（p＜0.01）;CAT、SOD、GSH-Px、GSH和MDA发生显著变化（p＜0.05或p＜0.01）。与模型组相比,LPS+DHM组ALT、AST和LDH活性极显著降低（p＜0.01）;TRIF、RIPK3、MLKL的表达及MLKL蛋白磷酸化显著降低（p＜0.05或p＜0.01）;IL-1β和IL-6的表达极显著降低（p＜0.01）;SOD、CAT、GSH-Px活性和GSH含量显著升高,MDA含量显著降低（p＜0.05或p＜0.01）。以上结果说明DHM能抑制程序性坏死、炎症反应和氧化应激从而缓解LPS致鸡肝脏损伤。（2）DHM对LPS诱导鸡原代肝细胞损伤的保护作用:复制鸡体外肝损伤模型,设置对照组、模型组、LPS+DHM组和DHM组。采用Annexin V-FITC/PI双染法分析细胞坏死情况;检测上清液ALT、AST和LDH活性;测定细胞IL-1β和IL-6 m RNA的表达水平;检测细胞TRIF、RIPK3、MLKL m RNA和蛋白表达及MLKL蛋白磷酸化的水平。Annexin V-FITC/PI染色结果显示,LPS引起大量鸡肝细胞坏死,而DHM可以明显减少坏死细胞数量。与对照组相比,模型组肝损伤指标、炎症因子的表达水平及程序性坏死相关因子的表达水平均发生显著变化（p＜0.05或p＜0.01）。与模型组相比,DHM显著降低肝损伤指标、炎症因子及程序性坏死相关因子的表达水平（p＜0.05或p＜0.01）。以上结果表明DHM可以抑制程序性坏死、炎症反应从而减轻LPS诱导的鸡肝细胞损伤。（3）DHM通过抑制TRIF/RIPK3/MLKL程序性坏死信号通路干预鸡肝细胞损伤:RIPK3是程序性坏死信号通路的枢纽,多条上游信号汇集于RIPK3,进一步诱导下游MLKL执行细胞死亡。GSK’872是RIPK3的特异性抑制剂,因此本试验应用GSK’872,通过检测细胞活力及肝损伤指标（ALT、AST和LDH）筛选GSK’872的最适作用浓度,结果表明1μM GSK’872对鸡肝细胞无明显毒性且显著降低肝损伤指标（p＜0.05或p＜0.01）,因此选用该浓度用于后续试验。设置对照组、模型组、LPS+GSK’872组、LPS+DHM组、LPS+DHM+GSK’872组和GSK’872组。检测上清液肝损伤指标和细胞TRIF、RIPK3、MLKL m RNA与蛋白表达及MLKL蛋白磷酸化的水平。结果显示,与模型组相比,LPS+GSK’872组肝损伤指标、RIPK3和MLKL的表达、MLKL蛋白的磷酸化水平显著降低（p＜0.05或p＜0.01）,而TRIF的表达差异不显著,说明GSK’872可以抑制RIPK3的表达从而进一步降低其下游MLKL的表达和蛋白磷酸化水平,但是对其上游TRIF的信号传导影响不明显;LPS+DHM组与LPS+DHM+GSK’872组肝损伤指标和TRIF、RIPK3、MLKL的表达及MLKL蛋白的磷酸化水平均显著降低（p＜0.05或p＜0.01）,并且LPS+DHM+GSK’872组降低的更明显,说明DHM对RIPK3上游及下游的信号传导均有抑制作用。以上结果表明DHM可以通过抑制TRIF/RIPK3/MLKL程序性坏死信号通路干预LPS致鸡肝细胞损伤。综上所述,在LPS诱导的鸡体内外肝损伤模型中,LPS通过激活TRIF/RIPK3/MLKL信号通路引起程序性坏死。DHM可以减轻鸡肝损伤中的氧化应激和炎症反应,并且通过抑制TRIF/RIPK3/MLKL程序性坏死信号通路缓解LPS诱导的鸡肝损伤。本课题为进一步研究DHM对鸡肝损伤的保护作用机制提供了数据基础,也为DHM的开发利用提供了科学依据。