目的近年来对骨髓间充质干细胞的研究初步显示其具有促进骨髓移植后供者细胞植入的作用。动物实验及临床统计都提示了骨髓间充质干细胞和造血干细胞的共同输注可以提高造血干细胞的植入，但骨髓间充质干细胞促进植入的机制尚不清楚。有关异基因造血干细胞移植后干细胞的归巢、增殖、分化相关研究中，其中一个研究热点是趋化因子及其受体的相互作用。趋化因子受体是一类表达于不同类型细胞上的含有7个跨膜区的G蛋白偶联受体超家族，通过与趋化因子作用参与细胞的生长、发育、分化、凋亡、组织分布等。它可以激活磷脂酶、脂类激酶、蛋白激酶，调节细胞内钙离子浓度，激活JAK／STAT途径，引发一系列的信号传导通路。现有的研究已经显示趋化因子及其受体对造血干细胞的游走和归巢有着重要作用：淋巴细胞在归巢的过程中通过细胞膜表面的CD62L粘附于高内皮微静脉（HEV），随后淋巴细胞表面的CCR7与内皮细胞表达的刺激淋巴组织趋化因子（SLC）相结合，CCR7-SLC的相互作用促进了T细胞归巢到淋巴结；在B细胞方面，BLC／CXCR5可以引导成熟B淋巴细胞游走和归巢，并对成熟B细胞在次级淋巴细胞中的B细胞区的发育有着重要作用。趋化因子及其受体除了可以促进造血细胞归巢，它们对造血细胞的增殖和分化也有重要作用：SDF-1／CXCR4参与了造血细胞的增殖、分化、迁移等活动，且早期B淋巴干细胞发育也需要CXCR4的表达；SDF-1、ELC、SLC、TECK、MDC等趋化因子在T细胞胸腺中分化的不同阶段发挥着不同的趋化作用，且SLC和ELC共同肩负着T细胞在二级淋巴器官内的分布。他们也在DC与T细胞的相互作用、T细胞的激活、极化、效应中起着重要的调节作用。基于趋化因子及其受体对造血细胞归巢及增殖分化方面的作用，为了解骨髓间充质干细胞促进造血干细胞植入的相关机制，我们研究了骨髓间充质干细胞对T细胞表面趋化因子受体表达的影响，进一步探索MSC的免疫调控机制。方法1、骨髓间充质干细胞的培养和生物学特性研究：无菌条件下采集健康志愿者骨髓液及C57BL／6小鼠股、胫骨骨髓，分别以2.0×10⁵的密度接种培养，24～48小时后弃去悬浮细胞，以后每3天换1次液。待细胞生长到80～90％融合时，按1：4～5的比例传代培养。分别取第1代，第3代和第5代绘制生长曲线。第4～5代各取2×10⁵个细胞，采用双色标记法标记CD34、CD44、CD166、HLA-DR单抗。经流式细胞仪分析阳性细胞的百分率。2、骨髓间充质干细胞对PHA诱导小鼠脾细胞增殖后趋化因子受体表达的影响：C57BL／6小鼠脾细胞以1×10⁶／孔的密度接种于24孔板，加入植物血凝素，培养72小时。实验分三组：A组按10％比例加入MSC；B组按1％比例加入MSC；对照组不加MSC。3天后收集悬浮的脾细胞进行流式细胞术检测。3、小鼠骨髓间充质干细胞与骨髓细胞联合输入动物模型的建立：无菌条件下取C57BL／6小鼠骨髓，骨髓移植第0天BALB／c小鼠经⁶⁰Co全身照射（TBI9.0Gy，0.5Gy／min），4小时内接受骨髓移植。实验分三组：A组BMC4×10⁷及MSC 4×10⁵；B组BMC4×10⁷及生理盐水；C组生理盐水。观察指标：1、小鼠的生存时间及一般情况；2、小鼠的体重变化。4、数据统计学分析：数据以用均数±标准差（x±s）或百分率（％）表示。采用SPSS 12.0 for Windows软件进行单因素方差分析，多组间进行LSD-test。结果：1、临床获取的健康人骨髓液经淋巴细胞分离液分离后，可获得乳白色的细胞层。该层细胞及C57BL／6小鼠骨髓单细胞悬液各自接种培养24～48小时后，弃去未贴壁细胞，可见贴壁生长的骨髓间充质干细胞散在分布，形态均呈梭形、扁平形和小圆形，约3～4天后贴壁细胞迅速增殖，6天后开始出现较大的克隆，10天左右细胞生长达到80％以上融合。细胞渐趋向均一的长梭形，漩涡状分布。待细胞生长到80～90％融合时传代培养，约7～10天传代一次，传代后细胞生长较原代细胞快，约7天左右细胞再次融合达80～90％。细胞形态逐渐趋向为螺旋状排列的长梭形细胞，类似成纤维细胞形态。连续传代约10代后细胞开始出现凋亡，块状死亡脱落后并片状蔓延。C57BL／6小鼠骨髓间充质干细胞形态上较健康人骨髓间充质干细胞小，细胞界限更清晰。从对P1、P2、P3代细胞的生长曲线进行观察，发现三代细胞具有以下共同特征：传代培养的潜伏期为24～36小时，对数增殖期约为2～3天，对数增殖期后第5天进入平台期。小鼠及健康人来源的骨髓间充质干细胞生长增殖规律大致相似。流式细胞仪检测生长良好的第3代hMSC显示CD44、CD166表达阳性，CD34、HLA-DR表达为阴性。2、脾细胞经PHA刺激及与MSC共培养后趋化因子受体表达变化：脾细胞经PHA刺激后均可检测到CCR5、CCR7及CXCR3三种趋化因子受体的表达，在MSC共培养体系中，趋化因子受体表达受MSC的影响且表达水平的变化与MSC浓度有关（表1）。实验结果表明，骨髓间充质干细胞在与CD3脾细胞呈一定的细胞比例共培养时能上调T细胞趋化因子受体CCR5、CCR7、CXCR3的表达，对前二者，在实验范围内随着MSC浓度的增高，趋化因子受体的表达越高。3、脾细胞经PHA刺激及与MSC共培养后各细胞亚群趋化因子受体表达变化：CXCR3阳性细胞中仅CD3⁺CD8⁺细胞群可以观察到趋化因子受体随着MSC浓度增高而表达增高，CD3⁺CD8^-细胞群在各浓度趋化因子受体表达无显著差异；CCR5阳性细胞主要在CD3⁺CD8^-细胞群中可以观察到趋化因子受体的表达随着MSC浓度增高而增强，CD3⁺CD8⁺细胞群仅在MSC浓度为10％时较无MSC时表达增高；CCR7阳性细胞则在CD3⁺CD8^-和CD3⁺CD8⁺细胞均可观察到趋化因子受体的表达随着MSC浓度增高而增强。4、+5天C组小鼠死亡66.7％，其余小鼠生存均超过30天。各组小鼠均出现毛发稀少、发抖等情况。考虑为照射后出现的非特异性表现。体重变化图提示A组小鼠体重缓慢上升，B组小鼠体重上升后有所下降，C组小鼠体重缓慢下降。结论1、骨髓间充质干细胞生长规律与文献报道相似，对本试验室条件下细胞生长周期及生长条件的掌握对下一步实验打下基础。2、流式细胞仪检测生长良好的第3代健康人MSC显示CD44、CD166表达阳性，CD34、HLA-DR表达为阴性。符合相关文献报道。3、骨髓间充质干细胞在与脾细胞呈一定的细胞比例共培养时能上调T细胞趋化因子受体CCR5、CCR7、CXCR3的表达，对前二者随着MSC细胞浓度提高，趋化因子受体表达更强。上述三种趋化因子受体在CD3⁺CD8^-和CD3⁺CD8⁺两大亚群中表达上调的分布不同。研究结果显示，骨髓间充质干细胞在一定浓度范围内能提高T细胞趋化因子受体表达，这可能有利于骨髓移植后促使淋巴细胞在趋化因子的作用下移行和归巢到骨髓及淋巴器官，从而有利于促进造血细胞植入。这可能是骨髓间充质干细胞促进异基因造血干细胞植入的机制之一。4、骨髓细胞与间充质干细胞混合输注的动物模型基本确立骨髓细胞输注的数量级，间充质干细胞输注后并未出现严重不良反应；经过照射的BALB／c小鼠可以出现非特异性照射病，表现为毛发耸起，发抖等；该动物模型为进一步行骨髓细胞与骨髓间充质干细胞共同输注的后续实验打下基础。