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乳汁中含有大量的营养物质,包括乳蛋白、乳脂肪和维生素等,是一种具有较高经济价值的农产品。乳腺的泌乳能力主要取决于乳腺上皮细胞（mammary epithelial cells,MECs）的乳合成和细胞增殖能力。揭示MECs乳合成的调节机理,有助于完善泌乳基因调控网络,并将为建立新型乳腺发育与泌乳调控技术提供基础理论依据。氨基酸是哺乳动物泌乳中最重要的调节因子之一,可以激活MECs乳合成和增殖的核心信号分子—哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（the mechanistic target of rapamycin,mTOR）以促进MECs中的乳合成,但具体机制有待进一步研究。AT丰富结合域1A（AT-rich interaction domain 1A,ARID1A）是染色质重塑复合物SWI/SNF中的成员,可调控细胞增殖、分化和凋亡,影响脂质稳态,发挥多种生物学功能,但ARID1A是否参与调节乳合成以及是否应答氨基酸信号,尚未见报道。本研究拟揭示ARID1A在氨基酸调节奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells,BMECs）乳合成过程中的作用和分子机理,研究结果将为氨基酸在乳生产中的实际应用提供理论与实验依据。本研究发现ARID1A在小鼠泌乳期乳腺组织中蛋白丰度显著低于青春期和退化期,而磷酸化mTOR的蛋白水平在泌乳期的表达显著高于青春期和退化期,提示ARID1A可能是乳合成的关键负向调节因子。通过消化法原代培养BMECs,免疫荧光鉴定角蛋白18（Cytokeratin18,CK18）和β-酪蛋白（β-casein）的表达以确定细胞纯度和泌乳能力。为确定ARID1A是否参与调控乳合成,以BMECs为研究对象,对ARID1A进行基因抑制和基因激活试验,通过Western blotting、BODIPY染色和甘油三酯（triglyceride,TG）含量检测发现,ARID1A基因抑制显著增加β-casein蛋白表达、TG的分泌和脂滴的形成。此外,细胞计数和CCK8检测发现ARID1A抑制促进BMECs的增殖。而ARID1A基因激活后β-casein蛋白表达、TG的分泌、脂滴的形成和细胞增殖均显著降低。以上数据表明ARID1A在BMECs乳合成和细胞增殖中起负调控作用。为研究ARID1A对mTOR基因表达和蛋白磷酸化激活的影响,Western blotting结合RTq PCR检测ARID1A抑制和基因激活后mTOR的磷酸化蛋白水平和mRNA表达。结果发现,ARID1A基因抑制显著促进磷酸化mTOR蛋白水平和mTOR mRNA的表达,而ARID1A基因激活后磷酸化mTOR蛋白水平和mTOR mRNA的表达均显著降低。以上数据表明ARID1A负向调节mTOR的mRNA表达和随后的蛋白激活。为进一步研究ARID1A抑制mTOR基因表达的机制,本研究通过Ch IP-PCR检测ARID1A和3个组蛋白修饰（H3K27ac、H3K4me3和H3K27me3）与mTOR启动子结合情况,Western blotting结合Ch IP-q PCR分析ARID1A基因抑制和基因激活对组蛋白修饰与mTOR启动子结合影响。结果表明,ARID1A基因抑制和基因激活均不改变H3K4me3、H3K27me3和H3K27ac的蛋白水平。但Ch IP-PCR分析发现ARID1A、H3K4me3、H3K27me3和H3K27ac均仅与mTOR启动子的-1～-2000 nt区域中的-548～-793 nt序列结合。Ch IP-q PCR检测到ARID1A抑制显著增加H3K27ac与mTOR启动子的结合,而ARID1A基因激活显著抑制H3K27ac与mTOR启动子的结合。ARID1A基因抑制和基因激活均对H3K4me3和H3K27me3与mTOR启动子的结合没有显著影响。这些数据表明ARID1A通过抑制H3K27ac在mTOR启动子上的沉积以抑制mTOR转录激活。为进一步研究ARID1A在氨基酸调节乳合成中是否发挥作用,同时添加0.6 mM蛋氨酸（methionine,Met）或0.6 mM亮氨酸（leucine,Leu）并对ARID1A进行基因激活,通过Western blotting、RT-q PCR、BODIPY染色、TG含量检测和CCK8细胞数量分析ARID1A基因激活对Met和Leu调节mTOR mRNA表达、乳合成和细胞增殖的影响。结果表明,ARID1A基因激活显著抑制Met和Leu刺激的mTOR磷酸化和mTOR mRNA表达。除此之外,ARID1A基因激活也显著抑制Met和Leu刺激的β-casein蛋白表达、TG的分泌、脂滴的形成和细胞增殖。这些数据表明ARID1A是Met和Leu调节mTOR mRNA表达、乳合成和细胞增殖的关键负向调节因子。上述研究同时发现,添加Met和Leu后ARID1A的蛋白水平显著下降,为进一步研究Met和Leu下调ARID1A蛋白水平的分子机制,Western blotting结合RT-q PCR检测添加Met和Leu后ARID1A的蛋白水平和mRNA表达,结果发现添加Met和Leu降低ARID1A的蛋白水平但不改变其mRNA表达,提示Met和Leu对ARID1A的调节与基因表达调控无关。为验证这一猜想,向细胞中添加氨基酸（0.6 mM Met或0.6 mM Leu）的同时添加10μg/mL蛋白合成抑制剂（cycloheximide,CHX）,CHX添加0,2,4,6 h并不改变ARID1A的蛋白水平,也不改变Met和Leu对ARID1A蛋白水平的下调作用,进一步提示Met和Leu对ARID1A蛋白水平的下调可能由蛋白降解引起。向细胞添加氨基酸的同时添加50 n M自噬抑制剂（chloroquine,CQ）或10μM蛋白酶体抑制剂MG132,Western blotting检测ARID1A的蛋白水平。结果表明,CQ的处理并没有改变Met和Leu对ARID1A蛋白水平的下调,但MG132处理恢复了Met和Leu下调的ARID1A蛋白水平。此外,还发现Met和Leu处理显著增加泛素化ARID1A的蛋白水平。这些数据表明Met和Leu通过泛素-蛋白酶体系统诱导ARID1A降解。为进一步探究Met和Leu诱导ARID1A降解的分子机制,本研究通过质谱分析和文献查阅发现E3泛素连接酶三结构域蛋白21（tripartite motif containing 21,TRIM21）可能与ARID1A泛素化降解相关。通过Western blotting和双向Co-IP分析检测发现,TRIM21存在于BMECs细胞核和细胞浆中,并且TRIM21和ARID1A存在相互作用。为研究TRIM21对Met和Leu诱导ARID1A降解的影响,添加Met和Leu及抑制TRIM21后,Western blotting检测ARID1A蛋白水平,发现抑制TRIM21后ARID1A蛋白水平显著升高。此外,Met和Leu刺激TRIM21的表达,而抑制TRIM21几乎完全消除Met和Leu诱导的ARID1A降解。上述数据表明,TRIM21是作用于ARID1A泛素化的E3泛素连接酶,是在BMECs中介导Met和Leu诱导ARID1A降解的关键信号分子。综上所述,ARID1A通过抑制mTOR启动子上H3K27ac沉积,负向调节BMECs中mTOR基因转录、乳合成和细胞增殖。Met和Leu通过TRIM21诱导ARID1A泛素化降解。Met和Leu通过TRIM21-ARID1A途径促进乳合成和细胞增殖。