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研究发现表观遗传学(Epigenetics)的改变是造成基因转录失调的重要原因，这种改变往往是可逆的，且不改变基因编码序列。大量的研究表明，肿瘤的发生是由多种肿瘤基因、肿瘤抑制基因的功能改变所引发的的多步骤过程，表观遗传学和（或）遗传学的改变都可以引起肿瘤的发生。
DNMT3b是DNMTs家族中重要的一员。由DNA甲基转移酶3b(DNAmethyltransferase3b,DNMT3b)催化完成的DNA启动子区甲基化是DNA的一种重要的修饰方法，是表观遗传学重要内容，在基因的表达调控、X染色体失活、基因组印记、胚胎发育调节及肿瘤的发生等方面发挥着重要的作用。在未分化的胚胎干细胞可以检测到DNMT3b的大量表达，其主要功能是催化DNA的甲基化，然而在人体的其他正常细胞中的表达量很低。DNA甲基化调控主要通过改变基因启动子区域的CpG岛的甲基化状态实现。基因启动子区域有大约50%的CpG岛位。在正常细胞中，位于基因启动子区域的大部分CpG岛是低甲基化状态。在恶性肿瘤细胞中，DNMT3b的高表达可以使某些肿瘤抑制基因启动子区CpG岛处于高甲基化状态，进而使该基因功能沉默，从而引起了肿瘤的发生。
胞周期素D1(cyclin D1,CCND1)基因定位于11q13，该蛋白质由295个氨基酸残基编码组成，全长约15kb。分子量约为36kb。CCND1基因可以通过激活CDK4导致pRb磷酸化，进而释放核转录因子E2F，促使DNA在细胞核内复制，使细胞迅速通过G1期进入S期，从而导致了细胞的恶性增殖。
MicroRNAs(miRNAs)是一类长度约为18-25核苷酸组成的单链、内源性、高度保守的非蛋白质编码小分子RNA。研究发现，动植物体内具有多种miRNAs，其功能主要功能是通过抑制蛋白质的翻译或者降解目标mRNA，进而参与调节细胞生长、分化、凋亡与增殖；此外，它们与机体代谢、个体发育等多种疾病的发生发展有着密切的关系。研究表明，miRNA可以在比较长的时间内稳定的存在于人类及动物的唾液、血液、尿液等体液中，具有调控细胞分化、发育、凋亡及增殖等作用。已有研究证实，miR-145在肿瘤中是抑癌基因，在肝癌细胞系中异常表达，并且在人类肿瘤的发生发展过程中占据重要作用。
第一部分：DNMT3b和CCND1在肝癌中的表达及其临床意义
目的：探究DNMT3b和CCND1在肝癌中的表达及其临床意义。
方法：1、TCGA数据库中DNMT3b基因在肝癌组织和癌旁组织中表达的相关数据分析。
2、免疫组化分析DNMT3b和CCND1在肝癌组织和癌旁组织中的表达；
3、qRT-PCR实验检测DNMT3b和CCND1在肝癌组织及癌旁组织中的表达；
4、皮尔森检验分析DNMT3b和CCND1在肝癌组织中表达水平的相关性；
结果：1、TCGA数据库分析表明DNMT3b在肝癌组织中高表达，并和肝癌患者的分期和生存率相关；
2、免疫组化分析结果表明DNMT3b和CCND1均在肝癌组织中高表达；
3、qRT-PCR结果显示，DNMT3b和CCND1在肝癌组织中的mRNA水平较癌旁组织显著升高，而miR-145含量明显降低；
4、皮尔森检验分析结果显示，DNMT3b和CCND1的mRNA水平在肝癌组织中呈显著正相关；
第二部分：DNMT3b对CCND1表达的调控作用及相关机制
目的：分析miR-145的表达水平与肝癌患者临床病理特征及预后的关系，并探究DNMT3b是否可通过调控miR-145的表达进而调控CCND1的表达。
方法：1、qRT-PCR检测miR-145在肝癌组织及癌旁组织中的表达；
2、miR-145的表达水平同肝癌患者临床病理特征之间的相关性分析；
3、生存曲线分析miR-145的表达水平同肝癌患者总生存期之间的关系
4、皮尔森检验分析miR-145同DNMT3b、CCND1在肝癌组织中表达水平的相关性；
5、qRT-PCR检测DNMT3b下调对miR-145和CCND1表达的影响；
6、甲基化特异性PCR(MS-PCR)检测DNMT3b下调对miR-145和CCND1启动子区甲基化的影响；
7、双荧光素酶报告基因实验探究miR-145和CCND1的关系；
8、Western blotting检测DNMT3b是否可通过调控miR-145的表达进而调控CCND1的表达。
结果：1、同癌旁正常组织相比，miR-145在肝癌组织中的含量明显降低；
2、miR-145的表达水平同肝癌患者瘤体大小、淋巴结转移和肝硬化的发生率及患者的TNM分期负相关；
3、较miR-145高表达的肝癌患者，miR-145低表达的患者术后总生存期明显降低；
4、在肝癌组织中，miR-145的表达水平同DNMT3b和CCND1的表达水平均呈现出显著负相关；
5、同对照组相比，DNMT3b下调后miR-145的表达水平升高，而CCND1的表达水平降低；
6、同对照组相比，DNMT3b下调对miR-145和CCND1的启动区的甲基化水平均无显著影响；
7、双荧光素酶实验表明miR-145可以靶向抑制CCND1的mRNA水平；
8、Western blotting实验结果显示，同对照组相比，DNMT3b下调后细胞中的DNMT3b和CCND1的表达水平明显降低；较si-DNMT3b组相比，miR-145mimic+DNMT3b siRNA组过表达miR-145后CCND1的表达水平降低更为明显，miR-145inhibitor+DNMT3b siRNA组抑制miR-145后CCND1的表达升高，然而miR-145mimic+DNMT3b siRNA组和miR-145inhibitor+DNMT3b siRNA组对DNMT3b的表达无明显影响。
第三部分：DNMT3b调控miR-145/CCND1在肝癌进展中的作用探究
目的：探究DNMT3b是否可通过调控miR-145/CCND1促进肝癌。
方法：1、应用siRNA转染下调肝癌细胞株SMMC7721和BEL-7402中DNMT3b的表达，分别应用MTT、克隆形成实验、流式细胞术、划痕和Transwell小室实验检测细胞的增殖、克隆形成活性、凋亡和周期、转移和侵袭能力；
2、细胞分为negtive control(NC)、DNMT3bsi、DNMT3bsi+miR-145inhibitor、miR-145inhibitor组，首先通过qRT-PCR和/或Western blot检测DNMT3b和miR-145的表达，其次应用MTT、克隆形成实验、流式细胞术、划痕和Transwell小室实验检测细胞的增殖、克隆形成活性、凋亡和周期、转移和侵袭能力；
3、细胞分为NC、miR-145inhibitor、miR-145inhibitor+CCND1si、CCND1si组，首先通过qRT-PCR和/或Western blot检测CCND1和miR-145的表达，其次应用MTT、克隆形成实验、流式细胞术、划痕和Transwell小室实验检测细胞的增殖、克隆形成活性、凋亡和周期、转移和侵袭能力；
4、利用肝癌细胞SMMC7721构建移植瘤裸鼠模型，构建稳定细胞株，分为NC、DNMT3bsh、DNMT3bsh+miR-145inhibitor、miR-145inhibitor、miR-145inhibitor+sh-CCND1、CCND1sh组，定期检测移植瘤的体积和重量；免疫组化和Western blotting检测移植瘤中DNMT3b和CCND1蛋白的表达，qRT-PCR检测移植瘤miR-145、DNMT3b和CCND1的表达。
结果：1、较对照组相比，DNMT3b下调后细胞的增殖、克隆形成、转移和侵袭能力明显降低，凋亡水平升高，且停滞在S期的细胞数量降低，而G2期的明显升高；
2、较对照组相比，下调miR-145后细胞的增殖、克隆形成、转移和侵袭能力明显增强，凋亡水平降低，且停滞在S期的细胞数量增多，而G2期的细胞数量明显降低；此外，抑制miR-145的表达明显削弱了DNMT3b对细胞功能的影响；
3、较对照组相比，miR-145inhibitor组miR-145表达明显降低，而CCND1表达明显升高，但这种趋势在CCND1下调后受到明显抑制；此外，CCND1下调后显著削弱了miR-145抑制对细胞功能的影响；
4、较对照组相比，下调DNMT3b和CCND1后，肝癌细胞的成瘤能力受到明显，而miR-145抑制后明显增强了细胞的成瘤能力；抑制miR-145削弱了DNMT3b下调对肿瘤成瘤能力的抑制；且下调CCND1也明显削弱了miR-145抑制对肿瘤成瘤能力的促进作用。
结论：下调DNMT3b可通过促进miR-145的表达抑制CCND1的表达，进而抑制肝癌细胞生长、转移、侵袭和荷瘤形成，促进肝癌细胞凋亡，同时降低S期细胞阻滞，提高G2期细胞量。本研究表明DNMT3b/miR-145/CCND1或许可成为肝癌基因治疗中的重要分子靶点。
DNMT3b是DNMTs家族中重要的一员。由DNA甲基转移酶3b(DNAmethyltransferase3b,DNMT3b)催化完成的DNA启动子区甲基化是DNA的一种重要的修饰方法，是表观遗传学重要内容，在基因的表达调控、X染色体失活、基因组印记、胚胎发育调节及肿瘤的发生等方面发挥着重要的作用。在未分化的胚胎干细胞可以检测到DNMT3b的大量表达，其主要功能是催化DNA的甲基化，然而在人体的其他正常细胞中的表达量很低。DNA甲基化调控主要通过改变基因启动子区域的CpG岛的甲基化状态实现。基因启动子区域有大约50%的CpG岛位。在正常细胞中，位于基因启动子区域的大部分CpG岛是低甲基化状态。在恶性肿瘤细胞中，DNMT3b的高表达可以使某些肿瘤抑制基因启动子区CpG岛处于高甲基化状态，进而使该基因功能沉默，从而引起了肿瘤的发生。
胞周期素D1(cyclin D1,CCND1)基因定位于11q13，该蛋白质由295个氨基酸残基编码组成，全长约15kb。分子量约为36kb。CCND1基因可以通过激活CDK4导致pRb磷酸化，进而释放核转录因子E2F，促使DNA在细胞核内复制，使细胞迅速通过G1期进入S期，从而导致了细胞的恶性增殖。
MicroRNAs(miRNAs)是一类长度约为18-25核苷酸组成的单链、内源性、高度保守的非蛋白质编码小分子RNA。研究发现，动植物体内具有多种miRNAs，其功能主要功能是通过抑制蛋白质的翻译或者降解目标mRNA，进而参与调节细胞生长、分化、凋亡与增殖；此外，它们与机体代谢、个体发育等多种疾病的发生发展有着密切的关系。研究表明，miRNA可以在比较长的时间内稳定的存在于人类及动物的唾液、血液、尿液等体液中，具有调控细胞分化、发育、凋亡及增殖等作用。已有研究证实，miR-145在肿瘤中是抑癌基因，在肝癌细胞系中异常表达，并且在人类肿瘤的发生发展过程中占据重要作用。
第一部分：DNMT3b和CCND1在肝癌中的表达及其临床意义
目的：探究DNMT3b和CCND1在肝癌中的表达及其临床意义。
方法：1、TCGA数据库中DNMT3b基因在肝癌组织和癌旁组织中表达的相关数据分析。
2、免疫组化分析DNMT3b和CCND1在肝癌组织和癌旁组织中的表达；
3、qRT-PCR实验检测DNMT3b和CCND1在肝癌组织及癌旁组织中的表达；
4、皮尔森检验分析DNMT3b和CCND1在肝癌组织中表达水平的相关性；
结果：1、TCGA数据库分析表明DNMT3b在肝癌组织中高表达，并和肝癌患者的分期和生存率相关；
2、免疫组化分析结果表明DNMT3b和CCND1均在肝癌组织中高表达；
3、qRT-PCR结果显示，DNMT3b和CCND1在肝癌组织中的mRNA水平较癌旁组织显著升高，而miR-145含量明显降低；
4、皮尔森检验分析结果显示，DNMT3b和CCND1的mRNA水平在肝癌组织中呈显著正相关；
第二部分：DNMT3b对CCND1表达的调控作用及相关机制
目的：分析miR-145的表达水平与肝癌患者临床病理特征及预后的关系，并探究DNMT3b是否可通过调控miR-145的表达进而调控CCND1的表达。
方法：1、qRT-PCR检测miR-145在肝癌组织及癌旁组织中的表达；
2、miR-145的表达水平同肝癌患者临床病理特征之间的相关性分析；
3、生存曲线分析miR-145的表达水平同肝癌患者总生存期之间的关系
4、皮尔森检验分析miR-145同DNMT3b、CCND1在肝癌组织中表达水平的相关性；
5、qRT-PCR检测DNMT3b下调对miR-145和CCND1表达的影响；
6、甲基化特异性PCR(MS-PCR)检测DNMT3b下调对miR-145和CCND1启动子区甲基化的影响；
7、双荧光素酶报告基因实验探究miR-145和CCND1的关系；
8、Western blotting检测DNMT3b是否可通过调控miR-145的表达进而调控CCND1的表达。
结果：1、同癌旁正常组织相比，miR-145在肝癌组织中的含量明显降低；
2、miR-145的表达水平同肝癌患者瘤体大小、淋巴结转移和肝硬化的发生率及患者的TNM分期负相关；
3、较miR-145高表达的肝癌患者，miR-145低表达的患者术后总生存期明显降低；
4、在肝癌组织中，miR-145的表达水平同DNMT3b和CCND1的表达水平均呈现出显著负相关；
5、同对照组相比，DNMT3b下调后miR-145的表达水平升高，而CCND1的表达水平降低；
6、同对照组相比，DNMT3b下调对miR-145和CCND1的启动区的甲基化水平均无显著影响；
7、双荧光素酶实验表明miR-145可以靶向抑制CCND1的mRNA水平；
8、Western blotting实验结果显示，同对照组相比，DNMT3b下调后细胞中的DNMT3b和CCND1的表达水平明显降低；较si-DNMT3b组相比，miR-145mimic+DNMT3b siRNA组过表达miR-145后CCND1的表达水平降低更为明显，miR-145inhibitor+DNMT3b siRNA组抑制miR-145后CCND1的表达升高，然而miR-145mimic+DNMT3b siRNA组和miR-145inhibitor+DNMT3b siRNA组对DNMT3b的表达无明显影响。
第三部分：DNMT3b调控miR-145/CCND1在肝癌进展中的作用探究
目的：探究DNMT3b是否可通过调控miR-145/CCND1促进肝癌。
方法：1、应用siRNA转染下调肝癌细胞株SMMC7721和BEL-7402中DNMT3b的表达，分别应用MTT、克隆形成实验、流式细胞术、划痕和Transwell小室实验检测细胞的增殖、克隆形成活性、凋亡和周期、转移和侵袭能力；
2、细胞分为negtive control(NC)、DNMT3bsi、DNMT3bsi+miR-145inhibitor、miR-145inhibitor组，首先通过qRT-PCR和/或Western blot检测DNMT3b和miR-145的表达，其次应用MTT、克隆形成实验、流式细胞术、划痕和Transwell小室实验检测细胞的增殖、克隆形成活性、凋亡和周期、转移和侵袭能力；
3、细胞分为NC、miR-145inhibitor、miR-145inhibitor+CCND1si、CCND1si组，首先通过qRT-PCR和/或Western blot检测CCND1和miR-145的表达，其次应用MTT、克隆形成实验、流式细胞术、划痕和Transwell小室实验检测细胞的增殖、克隆形成活性、凋亡和周期、转移和侵袭能力；
4、利用肝癌细胞SMMC7721构建移植瘤裸鼠模型，构建稳定细胞株，分为NC、DNMT3bsh、DNMT3bsh+miR-145inhibitor、miR-145inhibitor、miR-145inhibitor+sh-CCND1、CCND1sh组，定期检测移植瘤的体积和重量；免疫组化和Western blotting检测移植瘤中DNMT3b和CCND1蛋白的表达，qRT-PCR检测移植瘤miR-145、DNMT3b和CCND1的表达。
结果：1、较对照组相比，DNMT3b下调后细胞的增殖、克隆形成、转移和侵袭能力明显降低，凋亡水平升高，且停滞在S期的细胞数量降低，而G2期的明显升高；
2、较对照组相比，下调miR-145后细胞的增殖、克隆形成、转移和侵袭能力明显增强，凋亡水平降低，且停滞在S期的细胞数量增多，而G2期的细胞数量明显降低；此外，抑制miR-145的表达明显削弱了DNMT3b对细胞功能的影响；
3、较对照组相比，miR-145inhibitor组miR-145表达明显降低，而CCND1表达明显升高，但这种趋势在CCND1下调后受到明显抑制；此外，CCND1下调后显著削弱了miR-145抑制对细胞功能的影响；
4、较对照组相比，下调DNMT3b和CCND1后，肝癌细胞的成瘤能力受到明显，而miR-145抑制后明显增强了细胞的成瘤能力；抑制miR-145削弱了DNMT3b下调对肿瘤成瘤能力的抑制；且下调CCND1也明显削弱了miR-145抑制对肿瘤成瘤能力的促进作用。
结论：下调DNMT3b可通过促进miR-145的表达抑制CCND1的表达，进而抑制肝癌细胞生长、转移、侵袭和荷瘤形成，促进肝癌细胞凋亡，同时降低S期细胞阻滞，提高G2期细胞量。本研究表明DNMT3b/miR-145/CCND1或许可成为肝癌基因治疗中的重要分子靶点。