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研究背景和目的:目前,骨质疏松症是危及老年人生命与健康的主要疾病之一。另外,临床上骨延迟愈合、骨不连仍是骨科治疗难点。近年来,LMHFV作为一种非药物、非侵入性疗法,对骨质疏松症及骨不连的治疗取得了较好疗效,同时具有副作用小、经济负担低及患者依从性好等优势。我们课题组前期研究显示,生物力学研究上,间歇性低载荷机械振动加载能够更有效地对抗去势或悬吊引发的大鼠骨质疏松。对羊的体内研究也发现LMHFV能显著促进骨折愈合,并且采用间歇性LMHFV加载效果更好。细胞及分子生物学研究中,我们发现成骨细胞通过初级纤毛感知LMHFV加载从而上调成骨细胞OCN、ALP、COL-1等成骨相关蛋白的表达。然而,关于间歇LMHFV加载能够更有效地促进成骨的确切机制尚不清楚。关于这方面的研究,国内外未见报道。本课题将以此为切入点,研究间歇LMHFV加载促进成骨细胞成骨分化及矿化程度是否优于持续LMHFV加载,并探究初级纤毛在其中是否扮演重要角色。这将更加深入的阐释LMHFV等机械应力对成骨细胞功能影响的机制,为骨组织工程设计提供线索,同时优化LMHFV在治疗骨质疏松症及骨不连中的应用,并为其提供理论依据和指导。方法:对于研究间歇和持续LMHFV加载对MC3T3-E1细胞增殖、分化及矿化影响的实验,将细胞随机分为静置对照组、持续LMHFV组和间歇LMHFV组。对持续LMHFV组施加连续5天或12天每日30min,振动频率35Hz,振动强度0.25g的LMHFV,间歇LMHFV组隔日加载同样时长、强度和频率的LMHFV。5天的振动周期用于研究成骨分化,12天的振动周期用于研究成骨矿化。对研究初级纤毛在间歇和持续LMHFV加载促进MC3T3-E1细胞成骨分化及矿化中发挥的作用,将细胞随机分为持续LMHFV组、持续LMHFV加水合氯醛组、间歇LMHFV组和间歇LMHFV加水合氯醛组。其中持续LMHFV加水合氯醛组和间歇LMHFV加水合氯醛组的细胞培养液给予浓度4mM的水合氯醛干预。振动加载方式同前所述。对于研究单次LMHFV加载对成骨细胞初级纤毛形态和阳性率的影响的实验,将细胞随机分为静置对照组、LMHFV加载后1小时组、LMHFV加载后24小时组和LMHFV加载后48小时组。除对照组外每组施加30min,振动频率35Hz,振动强度0.25g的LMHFV,并分别于1小时后、24小时后和48小时后激光扫描共聚焦显微镜下观察初级纤毛的性状并进行定量分析。对于研究间歇和持续LMHFV加载对成骨细胞初级纤毛形态和阳性率的影响的实验,将细胞随机分为间歇LMHFV组和持续LMHFV组,再将每组分为第1天振动前1小时组、第1天振动后1小时组、第2天振动前1小时组和第3天振动前1小时组。持续LMHFV组施加连续每日30min,振动频率35Hz,振动强度0.25g的LMHFV,间歇LMHFV组隔日加载同样时长、强度和频率的LMHFV。实验采用激光扫描共聚焦显微镜、ELISA、免疫组化染色、Western Blot等方法进行定性及定量分析。结果:研究间歇和持续LMHFV加载对MC3T3-E1细胞增殖、分化及矿化发现,静置对照组、间歇LMHFV组和持续LMHFV组的总DNA含量无统计学差异(P>0.05)。与静置对照组ALP着色面积3.75±0.41cm~2相比,持续LMHFV组6.67±0.24cm~2(P<0.01),间歇LMHFV组7.74±0.33cm~2(P<0.01)。与静置对照组相比,间歇和持续LMHFV组OCN、COL-1表达量明显增高(P<0.01)。持续LMHFV组钙结节染色面积4.82±0.47cm~2和间歇LMHFV组6.62±0.61cm~2明显高于静置对照组2.14±0.22cm~2(P<0.01)。与持续LMHFV组相比,间歇LMHFV组ALP着色面积显著加深(P<0.05),OCN表达量明显升高(P<0.05),COL-1表达量也显著升高(P<0.01),并且钙结节染色面积也显著增加(P<0.01)。研究初级纤毛在间歇和持续LMHFV加载促进MC3T3-E1细胞成骨分化及矿化中的作用发现,浓度4mM的水合氯醛干预后,间歇LMHFV+CH组ALP着色面积3.72±0.47cm~2和持续LMHFV+CH组3.39±0.34cm~2、间歇LMHFV+CH组和持续LMHFV+CH组OCN、COL-1蛋白表达量以及间歇LMHFV+CH组钙结节染色面积2.08±0.24cm~2和持续LMHFV+CH组1.99±0.17cm~2均显著低于相应水合氯醛未干预组(P<0.01),且两组间ALP着色面积、OCN、COL-1蛋白表达量及钙结节染色面积均无统计学差异(P>0.05)。研究单次LMHFV加载对成骨细胞初级纤毛形态和阳性率的影响发现,静置对照组初级纤毛的阳性率为64.1±4.2%,LMHFV加载后1小时为34.6±3.6%(P<0.01)。与LMHFV加载后1小时组相比,LMHFV加载后24小时的初级纤毛阳性率为49.2±3.9%(P<0.01)。LMHFV加载后48小时的初级纤毛阳性率为62.8±4.4%与对照组阳性率接近(P>0.05)。静置对照组初级纤毛的长度为3.07±0.82μm,LMHFV加载后1小时为0.93±0.23μm(P<0.01)。与LMHFV加载后1小时组相比,LMHFV加载后24小时的初级纤毛长度为1.9±0.27μm(P<0.01)。LMHFV加载后48小时的初级纤毛长度为2.84±0.84μm与对照组长度接近(P>0.05)。研究间歇和持续LMHFV加载对初级纤毛形态和阳性率的影响发现,振动周期第1天LMHFV加载后1小时,间歇LMHFV组和持续LMHFV组的初级纤毛阳性率和长度显著下降,但两组间无明显差异(P>0.05)。振动周期第2天LMHFV加载前1小时,较前组相比,间歇LMHFV组和持续LMHFV组初级纤毛阳性率和长度有所回升,但两组间仍无明显差异(P>0.05)。直至振动周期第3天LMHFV加载前1小时,与振动周期第1天LMHFV加载前1小时初级纤毛阳性率63.52±3.9%相比,间歇LMHFV组初级纤毛阳性率63.47±2.6%(P>0.05),而与间歇LMHFV组相比,持续LMHFV组初级纤毛阳性率明显降低为27.7±1.8%(P<0.01)。与振动周期第1天LMHFV加载前1小时初级纤毛长度3.06±0.59μm相比,间歇LMHFV组初级纤毛长度2.96±0.47μm(P>0.05),而与间歇LMHFV组相比,持续LMHFV组初级纤毛长度明显降低为0.87±0.21μm(P<0.01)。结论:研究表明,间歇LMHFV和持续LMHFV能够通过成骨细胞初级纤毛感知并传导,上调成骨相关蛋白的表达并促进成骨细胞矿化,间歇LMHFV促进效果优于持续LMHFV。去除成骨细胞初级纤毛后,能够抵消间歇和持续LMHFV成骨的差异。通过对初级纤毛在间歇和持续LMHFV加载下形态和阳性率的变化,我们发现初级纤毛对LMHFV的感受存在消耗性。持续LMHFV加载会导致初级纤毛疲劳,而间歇LMHFV加载能使得初级纤毛得以一定程度的恢复,初级纤毛状态更佳,因此其产生的成骨效果更好。我们的发现为LMHFV诱导成骨的潜在机制提供了新的见解,并为LMHFV应用于对骨质疏松以及骨不连的治疗能够有针对性地优化LMHFV加载方案。