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猪血具有很高的营养价值与药用价值,而我国是生猪生产和屠宰加工大国,猪血资源十分丰富。但目前猪血的利用程度相当低,其中只有一小部分用来开发单一的产品,绝大部分作为废弃物予以排放,这不仅造成巨大的生物资源浪费,还引起了严重的环境污染。针对以上问题,本课题立足于猪血的综合利用,设计从猪血中提取具有抗肿瘤、抗衰老、治疗糖尿病、高血压作用的超氧化物歧化酶与具有重要医药价值、食用价值的血红素,不仅充分利用猪血资源,增加产品附加值,创造可观的经济价值,还能减少猪血随意排放带来的环境污染。
试验采用间歇式超声波法从猪血中提取超氧化物歧化酶与血红素。在原料处理方面,主要考察了超声功率、超声工作次数对超氧化物歧化酶与血红素提取的影响;在超氧化物歧化酶制备方面,主要考察了丙酮加入量、CuSO4加入量、热变温度、热变时间对超氧化物歧化酶活力的影响,采用正交试验优化其制备工艺,并在此基础上采用DEAE-32纤维素柱层析法进一步分离纯化超氧化物歧化酶,另外,对超氧化物歧化酶的性质也进行了研究;在血红素提取方面,主要考察了丙酮加入量、盐酸加入量、抽提时间、NaAc加入量对血红素纯度及提取率的影响,并采用正交试验优化其制备工艺。
结果表明:
(1)细胞破碎条件为:设置间歇时间5s,超声时间5s,超声功率200W,超声工作次数60,在该条件下细胞破碎程度高,并能保证较高的超氧化物歧化酶活性与血红素纯度及提取率。
(2)超氧化物歧化酶制备的最佳工艺条件为:丙酮加入量为1倍红细胞体积,热变前添加16%CuSO4溶液,于70℃水浴中保温15min,制备的粗酶液比活力达4855.445U/mg。
(3)超氧化物歧化酶的纯化条件为:将制备的粗酶液透析,经DEAE-32纤维素柱层析纯化,收集部分活性洗脱液,得到酶的总活力为22658.247U,总蛋白含量为2.093mg,比活力为10825.727U/mg,活力回收率为79.382%,纯化倍数为34.756。
(4)超氧化物歧化酶样品的性质:样品对KCN和H2O2敏感,表明猪血中制备的超氧化物歧化酶的种类是Cu Zn-SOD;在-20℃、4℃、25℃、30℃储存条件下,随着时间延长,活性逐渐降低,但在-20℃下,储存时间对超氧化物歧化酶活性影响较小;在50℃、60℃、70℃、80℃条件下,加热时间越长,SOD活性越低,但在50~60℃之间有一定稳定性;在pH6~9范围内,SOD酶活力基本稳定,在pH7~8酶活力较高。
(5)血红素提取的最佳工艺条件为:丙酮加入量为5倍红细胞体积,盐酸加入量为1.4%,抽提10min,加入0.75%的NaAc沉淀血红素,得到的产品用去离子水、95%乙醇依次各洗涤两次得到精品,制备血红素纯度达98.71%、提取率达62.48%。