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目的
地方性氟中毒是我国重点防控的地方病之一，在儿童中，除氟斑牙外，氟的发育神经毒性也逐渐引起广泛关注。动物和细胞实验表明，线粒体产生的活性氧增多及其功能障碍与氟神经毒性密切相关，而线粒体功能相关基因可能参与了氟神经毒性的发生发展。鉴于此，本研究拟在儿童群体中评估内、外氟暴露水平与智力水平和氟斑牙的剂量反应关系；进一步探讨线粒体相关基因遗传变异与儿童智力发育水平的关联，以及与氟暴露的交互作用；并利用体外功能实验探索氟致神经毒性的潜在生物学机制，为寻找氟神经毒性的早期生物学标志物进而实施早期干预提供更多的科学证据。
方法
(1)采用多阶段随机抽样方法选取天津市宝坻区7-13岁儿童共3020名作为研究对象，收集流行病学调查资料，采集尿液、头发和指甲样本，并进行体格检查、氟斑牙评估和智力测试。利用氟离子选择电极法测定儿童饮用水源、尿液、头发和指甲中的氟含量，综合地评估儿童内、外氟暴露水平。利用分段线性模型和多因素Logistic回归模型，分别分析水氟、尿氟、发氟和指甲氟的暴露水平与智力水平和氟斑牙患病之间的剂量效应关系及阈值和饱和效应，进一步探索氟斑牙与智力的关联。
(2)在第一阶段的基础上采用分层随机抽样方法选取1020名儿童作为研究对象并采集血液样本。采用文献回顾结合生物信息学的方法，选出与线粒体功能相关并参与神经系统发育的基因，利用Haploview软件和SNPinfo工具筛选出中国汉族人群最小等位基因频率≥0.05的潜在功能tagSNPs。采用多重PCR_SNP分型技术对候选SNPs进行分型。利用多因素Logistic回归模型分析各SNP在不同遗传模型下与智力水平的关联。应用LASSO回归构建与智力相关的SNP-set,利用广义线性模型分析SNP-set评分与智力水平的关联，以评估多个SNPs对智力的联合作用，进而采用多因素Logistic回归模型分析其与氟的交互作用。在基因和通路水平上，应用ARTP方法评估遗传变异与智力的关联，以及与氟的交互作用。最后利用SHEsis软件分析不同的单体型与智力的关联。
(3)在体外对SH-SY5Y细胞进行NaF梯度染毒实验，采用CCK-8、Real-timePCR、WesternBlot、免疫荧光和细胞流式等方法分别检测关键基因和蛋白的表达水平、细胞生存和凋亡情况、线粒体膜电位和氧化水平、线粒体动力学指标在不同氟染毒剂量下的变化情况。利用单因素方差分析比较不同氟染毒剂量组间的差异，两两比较采用最小差异法。
结果
(1)在氟暴露与儿童智力发育水平、氟斑牙的关联分析中，共有3020名7-13岁儿童纳入研究。水氟、尿氟、发氟和指甲氟的相关系数在0.34-0.76之间。氟暴露与智力呈非线性剂量效应关系，分段线性回归结果显示，水氟高于3.4mg/L时，每增加0.5mg/L，智商(intelligent quotient, IQ)下降4.07；尿氟在1.60-2.5mg/L之间时，每增加0.5mg/L，IQ值下降2.49，增至2.5mg/L时，IQ水平趋于稳定；发氟和指甲氟每增加1.0μg/g，IQ值分别降低2.24和1.30，分别在10.50μg/g和14.5μg/g趋于稳定。将智力分级后进行Logistic回归分析，结果显示在0.20-1.40mg/L的范围内，水氟每增加0.5mg/L，极优智力(IQ≥130)减少53%(OR=0.47,95%CI:0.47,0.77)；尿氟每增加0.5mg/L，极优智力减少13%(OR=0.87,95%CI:0.75,1.00)；发氟每增加1.0μg/g，极优智力和优秀智力(120-129)分别减少36%(OR=0.64,95%CI:0.52,0.79)和43%(OR=0.57,95%CI:0.49,0.67)，且在10.5μg/g时减少趋势放缓；指甲氟每增加1.0μg/g，极优智力和优秀智力分别减少24%(OR=0.76,95%CI:0.66,0.87)和28%(OR=0.72,95%CI:0.64,0.82)，当指甲氟分别超过18.5μg/g和14.5μg/g后，极优智力和优秀智力减少趋势放缓。氟暴露水平与氟斑牙的关联也存在阈值和饱和效应。水氟在0.80-1.50mg/L时，每增加0.1mg/L，氟斑牙患病风险增加127%(95%CI:104%, 152%)；尿氟低于2.0mg/L时，每增加0.5mg/L，氟斑牙患病风险增加167%(95% CI: 137%, 201%)；发氟每增加1.0μg/g，氟斑牙患病风险增加9%(95%CI:7%, 12%)；指甲氟低于20.0μg/g时，每增加1.0μg/g，氟斑牙风险增加14%(95%CI:9%, 20%)，超出该剂量时氟斑牙风险的增加趋于平缓。氟斑牙与智力等级的关联分析显示，氟斑牙程度每增加一个等级，极优智力的可能性减少30%(OR=0.70,95%CI:0.57,0.86)。
(2)在基因-环境交互作用分析中，共有17个基因的53个质控合格的SNPs入选，在1020名研究对象中，有68例个体因分型检出率低于95％被剔除，最终共有952名研究对象纳入分析。经FDR校正后，未发现单个SNP与智力有显著关联。利用LASSO回归筛选出智力相关的重要SNP，根据基因型中风险等位基因的个数将SNP分别编码为0、1、2，结合Logistic回归构建加权的SNP-set=-0.281×rs3788319-0.273×rs1879417-0.241×rs57377675-0.518×rs11556505-
0.257×rs7187776，其评分与智力正相关(Ptrend=0.001)。SNP-set与水氟、尿氟和发氟均具有交互作用(P=0.030,0.040,0.010)。应用ARTP模型分析基因和通路水平上遗传变异和智力的关联及与氟的交互作用，结果显示，在男性中，Dopaminergicsynapsepathway与智力相关(P=0.044)，Metabolicpathway与智力的相关具有边缘统计学意义(P=0.071)，经FDR校正后关联不再显著。交互作用分析中，Dopaminergicsynapsepathway与指甲氟未经FDR校正时在男性中存在交互(P=0.049)；Alzheimerdiseasepathway在男性中与水氟、尿氟和发氟均存在交互(P=0.007,0.024,0.078)，经FDR校正后与水氟的交互作用仍显著(P=0.049)，与尿氟的交互作用为边缘性显著(0.074)；Neurotrophinsignalingpathway在男性中与发氟和指甲氟交互(P=0.039,0.041)，在女性中与发氟交互(P=0.075)，经FDR校正后交互作用失去显著性；Metabolicpathway在男性中与水氟和尿氟具有交互作用(P=0.032,0.051)，经FDR校正后的P值均为0.074，具有边缘显著性。Signaltransductionpathway在男性中与水氟、尿氟交互(P=0.050,0.030)，在女性中与发氟交互(P=0.053)，经FDR校正后前两者的P值具有边缘统计学意义，均为0.074；Sphingolipidsignalingpathway在男性中与水氟、尿氟存在交互(P=0.036,0.041)，在女性中与发氟和指甲氟交互(P=0.089,0.019)，经FDR调整后与水氟和尿氟的交互作用为边缘性显著(P均为0.074)；在男性中，PI3K-AKTsignalingpathway与水氟、尿氟、发氟和指甲氟均具有交互作用(P=0.051,0.053,0.067,0.079)，经FDR调整后前两者的P值具有边缘显著性，均为0.074。这些作用可能主要与COMT、NOS1、NOS3、SLC25A12、TH、TUFM和TOMM40等关键基因有关。
(3)在体外SH-SY5Y细胞NaF染毒实验中，随着氟染毒剂量的升高，COMT(P=0.049)、NOS1(P=0.002)、NOS3(P＜0.001)、TH(P=0.002)和TOMM40(P=0.002)基因的表达增加，对应的COMT(P=0.007)、NOS(P＜0.001)、TH(P＜0.001)和TOMM40(P＜0.001)蛋白的表达也增加；SLC25A12(P＜0.001)和TUFM(P＜0.001)基因的表达下降，对应的SLC25A12(P＜0.001)和TUFM(P＜0.001)蛋白的表达也下降；线粒体膜电位降低(P＜0.001)，活性氧含量升高(P＜0.001)；线粒体转运蛋白Miro1(P＜0.001)、自噬相关蛋白ATG5(P＜0.001)和PINK1(P=0.001)的表达均增加；细胞早期凋亡率(P＜0.001)和总凋亡(P＜0.001)均上升，凋亡相关蛋白PARP和Cleavedcaspase-3的表达明显增多(P=0.027,0.007)，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达则显著减少(P=0.001)。
结论
(1)低中度氟暴露水平下儿童仍有氟斑牙患病和智力损失的风险，其剂量效应关系存在阈值和饱和效应，对智力的影响也体现在优秀/极优智力的损失，且氟斑牙与极优智力的损失呈正相关。
(2)在SNP-set、基因和通路水平均发现遗传变异与智力相关且与氟存在交互，部分存在性别差异。这些作用可能与COMT、NOS1、NOS3、SLC25A12、TH、TUFM和TOMM40等关键基因有关，潜在的作用通路为Metabolicpathway。
(3)高剂量氟可上调COMT、NOS1、NOS3、TH和TOMM40基因和蛋白表达，下调SLC25A12和TUFM基因和蛋白表达，促进线粒体的氧化应激、转运和自噬，并诱导神经元凋亡。氟可能通过影响关键基因和蛋白的表达干扰线粒体功能及诱导凋亡来发挥神经毒性作用。以上结论需要在大样本人群中验证，且仍需更深入的生物学机探索。
地方性氟中毒是我国重点防控的地方病之一，在儿童中，除氟斑牙外，氟的发育神经毒性也逐渐引起广泛关注。动物和细胞实验表明，线粒体产生的活性氧增多及其功能障碍与氟神经毒性密切相关，而线粒体功能相关基因可能参与了氟神经毒性的发生发展。鉴于此，本研究拟在儿童群体中评估内、外氟暴露水平与智力水平和氟斑牙的剂量反应关系；进一步探讨线粒体相关基因遗传变异与儿童智力发育水平的关联，以及与氟暴露的交互作用；并利用体外功能实验探索氟致神经毒性的潜在生物学机制，为寻找氟神经毒性的早期生物学标志物进而实施早期干预提供更多的科学证据。
方法
(1)采用多阶段随机抽样方法选取天津市宝坻区7-13岁儿童共3020名作为研究对象，收集流行病学调查资料，采集尿液、头发和指甲样本，并进行体格检查、氟斑牙评估和智力测试。利用氟离子选择电极法测定儿童饮用水源、尿液、头发和指甲中的氟含量，综合地评估儿童内、外氟暴露水平。利用分段线性模型和多因素Logistic回归模型，分别分析水氟、尿氟、发氟和指甲氟的暴露水平与智力水平和氟斑牙患病之间的剂量效应关系及阈值和饱和效应，进一步探索氟斑牙与智力的关联。
(2)在第一阶段的基础上采用分层随机抽样方法选取1020名儿童作为研究对象并采集血液样本。采用文献回顾结合生物信息学的方法，选出与线粒体功能相关并参与神经系统发育的基因，利用Haploview软件和SNPinfo工具筛选出中国汉族人群最小等位基因频率≥0.05的潜在功能tagSNPs。采用多重PCR_SNP分型技术对候选SNPs进行分型。利用多因素Logistic回归模型分析各SNP在不同遗传模型下与智力水平的关联。应用LASSO回归构建与智力相关的SNP-set,利用广义线性模型分析SNP-set评分与智力水平的关联，以评估多个SNPs对智力的联合作用，进而采用多因素Logistic回归模型分析其与氟的交互作用。在基因和通路水平上，应用ARTP方法评估遗传变异与智力的关联，以及与氟的交互作用。最后利用SHEsis软件分析不同的单体型与智力的关联。
(3)在体外对SH-SY5Y细胞进行NaF梯度染毒实验，采用CCK-8、Real-timePCR、WesternBlot、免疫荧光和细胞流式等方法分别检测关键基因和蛋白的表达水平、细胞生存和凋亡情况、线粒体膜电位和氧化水平、线粒体动力学指标在不同氟染毒剂量下的变化情况。利用单因素方差分析比较不同氟染毒剂量组间的差异，两两比较采用最小差异法。
结果
(1)在氟暴露与儿童智力发育水平、氟斑牙的关联分析中，共有3020名7-13岁儿童纳入研究。水氟、尿氟、发氟和指甲氟的相关系数在0.34-0.76之间。氟暴露与智力呈非线性剂量效应关系，分段线性回归结果显示，水氟高于3.4mg/L时，每增加0.5mg/L，智商(intelligent quotient, IQ)下降4.07；尿氟在1.60-2.5mg/L之间时，每增加0.5mg/L，IQ值下降2.49，增至2.5mg/L时，IQ水平趋于稳定；发氟和指甲氟每增加1.0μg/g，IQ值分别降低2.24和1.30，分别在10.50μg/g和14.5μg/g趋于稳定。将智力分级后进行Logistic回归分析，结果显示在0.20-1.40mg/L的范围内，水氟每增加0.5mg/L，极优智力(IQ≥130)减少53%(OR=0.47,95%CI:0.47,0.77)；尿氟每增加0.5mg/L，极优智力减少13%(OR=0.87,95%CI:0.75,1.00)；发氟每增加1.0μg/g，极优智力和优秀智力(120-129)分别减少36%(OR=0.64,95%CI:0.52,0.79)和43%(OR=0.57,95%CI:0.49,0.67)，且在10.5μg/g时减少趋势放缓；指甲氟每增加1.0μg/g，极优智力和优秀智力分别减少24%(OR=0.76,95%CI:0.66,0.87)和28%(OR=0.72,95%CI:0.64,0.82)，当指甲氟分别超过18.5μg/g和14.5μg/g后，极优智力和优秀智力减少趋势放缓。氟暴露水平与氟斑牙的关联也存在阈值和饱和效应。水氟在0.80-1.50mg/L时，每增加0.1mg/L，氟斑牙患病风险增加127%(95%CI:104%, 152%)；尿氟低于2.0mg/L时，每增加0.5mg/L，氟斑牙患病风险增加167%(95% CI: 137%, 201%)；发氟每增加1.0μg/g，氟斑牙患病风险增加9%(95%CI:7%, 12%)；指甲氟低于20.0μg/g时，每增加1.0μg/g，氟斑牙风险增加14%(95%CI:9%, 20%)，超出该剂量时氟斑牙风险的增加趋于平缓。氟斑牙与智力等级的关联分析显示，氟斑牙程度每增加一个等级，极优智力的可能性减少30%(OR=0.70,95%CI:0.57,0.86)。
(2)在基因-环境交互作用分析中，共有17个基因的53个质控合格的SNPs入选，在1020名研究对象中，有68例个体因分型检出率低于95％被剔除，最终共有952名研究对象纳入分析。经FDR校正后，未发现单个SNP与智力有显著关联。利用LASSO回归筛选出智力相关的重要SNP，根据基因型中风险等位基因的个数将SNP分别编码为0、1、2，结合Logistic回归构建加权的SNP-set=-0.281×rs3788319-0.273×rs1879417-0.241×rs57377675-0.518×rs11556505-
0.257×rs7187776，其评分与智力正相关(Ptrend=0.001)。SNP-set与水氟、尿氟和发氟均具有交互作用(P=0.030,0.040,0.010)。应用ARTP模型分析基因和通路水平上遗传变异和智力的关联及与氟的交互作用，结果显示，在男性中，Dopaminergicsynapsepathway与智力相关(P=0.044)，Metabolicpathway与智力的相关具有边缘统计学意义(P=0.071)，经FDR校正后关联不再显著。交互作用分析中，Dopaminergicsynapsepathway与指甲氟未经FDR校正时在男性中存在交互(P=0.049)；Alzheimerdiseasepathway在男性中与水氟、尿氟和发氟均存在交互(P=0.007,0.024,0.078)，经FDR校正后与水氟的交互作用仍显著(P=0.049)，与尿氟的交互作用为边缘性显著(0.074)；Neurotrophinsignalingpathway在男性中与发氟和指甲氟交互(P=0.039,0.041)，在女性中与发氟交互(P=0.075)，经FDR校正后交互作用失去显著性；Metabolicpathway在男性中与水氟和尿氟具有交互作用(P=0.032,0.051)，经FDR校正后的P值均为0.074，具有边缘显著性。Signaltransductionpathway在男性中与水氟、尿氟交互(P=0.050,0.030)，在女性中与发氟交互(P=0.053)，经FDR校正后前两者的P值具有边缘统计学意义，均为0.074；Sphingolipidsignalingpathway在男性中与水氟、尿氟存在交互(P=0.036,0.041)，在女性中与发氟和指甲氟交互(P=0.089,0.019)，经FDR调整后与水氟和尿氟的交互作用为边缘性显著(P均为0.074)；在男性中，PI3K-AKTsignalingpathway与水氟、尿氟、发氟和指甲氟均具有交互作用(P=0.051,0.053,0.067,0.079)，经FDR调整后前两者的P值具有边缘显著性，均为0.074。这些作用可能主要与COMT、NOS1、NOS3、SLC25A12、TH、TUFM和TOMM40等关键基因有关。
(3)在体外SH-SY5Y细胞NaF染毒实验中，随着氟染毒剂量的升高，COMT(P=0.049)、NOS1(P=0.002)、NOS3(P＜0.001)、TH(P=0.002)和TOMM40(P=0.002)基因的表达增加，对应的COMT(P=0.007)、NOS(P＜0.001)、TH(P＜0.001)和TOMM40(P＜0.001)蛋白的表达也增加；SLC25A12(P＜0.001)和TUFM(P＜0.001)基因的表达下降，对应的SLC25A12(P＜0.001)和TUFM(P＜0.001)蛋白的表达也下降；线粒体膜电位降低(P＜0.001)，活性氧含量升高(P＜0.001)；线粒体转运蛋白Miro1(P＜0.001)、自噬相关蛋白ATG5(P＜0.001)和PINK1(P=0.001)的表达均增加；细胞早期凋亡率(P＜0.001)和总凋亡(P＜0.001)均上升，凋亡相关蛋白PARP和Cleavedcaspase-3的表达明显增多(P=0.027,0.007)，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达则显著减少(P=0.001)。
结论
(1)低中度氟暴露水平下儿童仍有氟斑牙患病和智力损失的风险，其剂量效应关系存在阈值和饱和效应，对智力的影响也体现在优秀/极优智力的损失，且氟斑牙与极优智力的损失呈正相关。
(2)在SNP-set、基因和通路水平均发现遗传变异与智力相关且与氟存在交互，部分存在性别差异。这些作用可能与COMT、NOS1、NOS3、SLC25A12、TH、TUFM和TOMM40等关键基因有关，潜在的作用通路为Metabolicpathway。
(3)高剂量氟可上调COMT、NOS1、NOS3、TH和TOMM40基因和蛋白表达，下调SLC25A12和TUFM基因和蛋白表达，促进线粒体的氧化应激、转运和自噬，并诱导神经元凋亡。氟可能通过影响关键基因和蛋白的表达干扰线粒体功能及诱导凋亡来发挥神经毒性作用。以上结论需要在大样本人群中验证，且仍需更深入的生物学机探索。