论文部分内容阅读
第一章膀胱癌化疗药物敏感细胞和耐药细胞中CCND2和P2RY1基因的表达与miR-34b-3p基因表达的相关性研究目的:探讨在膀胱癌化疗药物敏感细胞系（5637）和膀胱癌化疗药物耐药细胞系（EJ）中,CCND2和P2RY1基因的表达水平与miR-34b-3p表达水平的相关性,以及CCND2和P2RY1是否为miR-34b-3p的调控靶基因。方法:1.qRT-PCR技术检测miR-34b-3p基因在膀胱癌化疗药物敏感细胞系（5637）和膀胱癌化疗药物耐药细胞系（EJ）的表达水平。2.western和qRT-PCR技术检测CCND2和P2RY1基因在膀胱癌化疗药物敏感细胞系（EJ）和膀胱癌化疗药物耐药细胞系（5637）的表达水平。3.细胞转染技术在膀胱癌化疗敏感细胞系（5637）和化疗耐药细胞系（EJ）中分别转染miR-34b-3p的mimic和antagomir,qRT-PCR技术检测miR-34b-3p的表达水平改变情况;western和qRT-PCR实验检测CCND2和P2RY1基因表达水平的改变情况。4.双荧光素酶报告基因检测在膀胱癌化疗药物敏感细胞系（5637）和膀胱癌化疗药物耐药细胞系（EJ）中CCND2和P2RY1基因是否受miR-34b-3p的调控。结果:1.miR-34b-3p基因在膀胱癌化疗药物敏感细胞系（5637）中的表达水平低于耐药细胞系（EJ）。2.CCND2和P2RY1基因在膀胱癌化疗敏感细胞系（5637）中的表达水平高于化疗耐药细胞系（EJ）。3.膀胱癌化疗敏感细胞系（5637）转染miR-34b-3p的mimic后miR-34b-3p的表达升高,而CCND2和P2RY1的表达降低;在耐药细胞系（EJ）中antagomir后miR-34b-3p的表达降低,而CCND2和P2RY1的表达升高。4.双荧光素酶报告基因表明膀胱癌细胞系中CCND2和P2RY1是miR-34b-3p的调控靶基因。结论:qRT-PCR、western和双荧光素酶报告基因技术检测表明CCND2和P2RY1基因的表达水平与miR-34b-3p的表达水平呈负相关性,miR-34b-3p参与调控CCND2和P2RY1基因的表达。第二章miR-34b-3p通过CCND2和P2RY1基因抑制膀胱癌细胞化疗耐药的研究目的:探讨miR-34b-3p、CCND2和P2RY1基因对膀胱癌细胞化疗耐药性、细胞凋亡和细胞周期的影响。探讨裸鼠皮下移植瘤实验中miR-34b-3p对膀胱癌细胞化疗耐药的影响。方法:1.细胞转染技术在膀胱癌化疗敏感细胞系（5637）和化疗耐药细胞系（EJ）中分别转染miR-34b-3p的mimic和antagomir,qRT-PCR技术检测miR-34b-3p的表达水平改变情况;CCK8实验测定膀胱癌细胞对紫杉醇（PA）、吡柔比星（PI）、盐酸表阿霉素（EH）、阿霉素（AD）和顺铂（CI）五种临床化疗药物的细胞存活数。2.细胞转染技术在膀胱癌化疗敏感细胞系（5637）中分别转染CCND2和P2RY1基因的干扰RNA,qRT-PCR和western检测表明CCND2和P2RY1基因表达水平的改变情况;CCK8实验测定膀胱癌5637细胞对紫杉醇（PA）、吡柔比星（PI）、盐酸表阿霉素（EH）、阿霉素（AD）和顺铂（CI）五种临床化疗药物的细胞存活数。3.在膀胱癌化疗耐药细胞系（EJ）细胞中感染构建好的CCND2和P2RY1慢病毒,qRT-PCR技术检测表明CCND2和P2RY1基因表达水平的改变情况;CCK8实验测定膀胱癌EJ细胞对紫杉醇（PA）、吡柔比星（PI）、盐酸表阿霉素（EH）、阿霉素（AD）和顺铂（CI）五种临床化疗药物的细胞存活数。4.在膀胱癌化疗敏感细胞系（5637）和化疗耐药细胞系（EJ）中分别转染miR-34b-3p的mimic和antagomir,在膀胱癌化疗敏感细胞系（5637）中分别转染CCND2和P2RY1基因的干扰RNA,细胞流式实验检测细胞凋亡发生的变化。5.在膀胱癌化疗敏感细胞系（5637）和化疗耐药细胞系（EJ）中分别转染miR-34b-3p的mimic和antagomir,在膀胱癌化疗敏感细胞系（5637）中分别转染CCND2和P2RY1基因的干扰RNA,细胞流式实验检测细胞周期发生的变化。6.在膀胱癌化疗敏感细胞系（5637）转染miR-34b-3p的mimic后,裸鼠皮下成瘤,再分别腹腔注射紫杉醇（PA）和PBS,定期测量成瘤体积的增长情况,处死后对瘤体称重,同时检测瘤组织CCND2和P2RY1基因的表达情况。结果:1.在膀胱癌化疗敏感细胞系（5637）和化疗耐药细胞系（EJ）中分别转染miR-34b-3p的mimic和antagomir,miR-34b-3p的表达水平分别升高和降低;CCK8实验表明转染mimic后细胞细胞存活率下降,而antagomir后细胞存活率升高。2.在化疗敏感细胞系（5637）中转染si-CCND2和si-P2RY1,qRT-PCR和western技术检测CCND2和P2RY1基因在膀胱癌化疗敏感细胞（5637）中的表达水平较对照（NC）均有下降。CCK8实验结果表明转染si-CCND2和si-P2RY1后,5637细胞对5种化疗药物存活率均出现不同程度的下降。3.在耐药细胞系（EJ）中感染构建好的CCND2和P2RY1过表达慢病毒,qRT-PCR检测表明CCND2和P2RY1基因表达水平均升高;CCK8实验表明,感染CCND2和P2RY1过表达慢病毒后,EJ细胞对5种化疗药物存活率均出现不同程度的上升。4.在敏感细胞系（5637）和化疗耐药细胞系（EJ）中分别转染miR-34b-3p的mimic和antagomir,细胞凋亡率分别发生升高和降低;在敏感细胞系（5637）中分别转染CCND2和P2RY1基因的干扰RNA,细胞凋亡率分别发生升高。5.在敏感细胞系（5637）和耐药细胞系（EJ）中分别转染miR-34b-3p的mimic和antagomir,细胞周期中G2/M占比分别发生升高和降低;在敏感细胞系中分别转染CCND2和P2RY1基因的干扰RNA,细胞周期中G2/M占比均发生变化。6.裸鼠皮下移植瘤实验中,裸鼠成瘤显示3PM+PBS组瘤体体积明显小于NC+PBS组,而3PM+PA组瘤体体积又明显小于NC+PA组,紫杉醇处理组瘤体体积又小于PBS处理组。3PM+PBS组瘤体CCND2和P2RY1蛋白表达水平小于NC+PBS组瘤体CCND2和P2RY1蛋白表达水平,而3PM+PA组瘤体CCND2和P2RY1蛋白表达水平又明显少于NC+PA组瘤体CCND2和P2RY1蛋白表达水平。结论:CCK8实验表明,miR-34b-3p能够抑制膀胱癌细胞的化疗耐药,CCND2和P2RY1促进膀胱癌细胞的化疗耐药性。细胞凋亡、细胞周期和裸鼠皮下移植瘤实验表明miR-34b-3p、CCND2和P2RY1基因影响膀胱癌细胞的化疗耐药。第三章miR-34b-3p/CCND2/P2RY1通过Notch和PKC/Ca++信号通路参与膀胱癌细胞化疗耐药的研究目的:探讨miR-34b-3p/CCND2/P2RY1对膀胱癌细胞与癌症相关信号通路的影响。方法:1.在膀胱癌化疗敏感细胞系（5637）和化疗耐药细胞系（EJ）中分别转染7种癌症相关信号转导报告基因质粒,确立两株细胞间的信号传导通路活性的差异谱。2.在膀胱癌化疗敏感细胞系（5637）和化疗耐药细胞系（EJ）中再分别转染miR-34b-3p的mimic和antagomir,鉴定差异较大的通路活性的改变情况。3.在膀胱癌化疗敏感（5637）中转染si-CCND2和si-P2RY1,鉴定差异较大的通路活性的改变情况。4.qRT-PCR检测7种癌症相关信号通路中关键转录因子在膀胱癌敏感细胞和耐药细胞中的表达水平;在敏感细胞中转染si-CCND2和si-P2RY1,qRT-PCR检测7种癌症相关信号通路中关键转录因子在膀胱癌化疗敏感细胞中表达变化情况。结果:1.7种常见癌症相关信号转导途径报告基因检测系统表明,在膀胱癌化疗敏感和耐药细胞中信号传导通路活性差异较大的有Notch、NF-kB和PKC/Ca++。2.在膀胱癌化疗敏感和耐药细胞中分别转染miR-34b-3p的mimic和antagomir后,Notch和PKC/Ca++的信号活性变化符合规律。3.在敏感细胞中转染si-CCND2和si-P2RY1,Notch和PKC/Ca++的信号活性变化符合规律。4.p53/DNA damage、TGFβ、NF-kB、MAPK/ERK和PKC/Ca++癌症相关信号通路中关键转录因子在膀胱癌耐药细胞表达水平高于敏感细胞;Notch和Hedgehog转录因子在膀胱癌敏感细胞表达水平低于耐药细胞。在膀胱癌敏感细胞5637中分别转染miR-34b-3p的mimic、si-CCND2和si-P2RY1后RBP-Jκ和NFAT的表达均增高,变化一致。结论:miR-34b-3p/CCND2/P2RY1通过Notch和PKC/Ca++信号通路参与膀胱癌细胞化疗耐药。