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据世界卫生组织报道,全球每年约有1800万人死于心血管疾病,预期到2030年,这一数字将会攀升到2300万人。心血管疾病已经成为危害人类生命健康的重大公共卫生问题。目前,随着社会生活水平的提高及老龄化的发展,我国心血管疾病患者高达2.9亿人,这种常见的慢性非传染性疾病已成为危害中老年甚至年轻人健康的大敌。心肌肥厚是心血管疾病的独立危险因素,其病理过程主要包括心肌细胞肥大、细胞凋亡及心脏纤维化等,受复杂的信号通路调控。目前,尽管β受体阻滞剂、血管紧张素转化酶抑制剂等改善病理性心肌肥厚和心室重构的药物已经广泛应用,但心肌肥厚的终点结局——心力衰竭的发病率仍然居高不下。因此,深入研究病理性心肌肥厚发生与发展的分子机制,将有望为临床抑制病理性心脏重构和心力衰竭提供新的治疗靶点。
前列腺六次跨膜蛋白3(STEAP3)作为一种金属还原酶,在维持人体铁稳态方面发挥着重要作用,并参与调控细胞的增殖、凋亡、炎症、纤维化等重要生物学事件。STEAP3在细胞内调控的信号通路和铁稳态均与心肌肥厚的发生发展机制密切相关。然而,目前国内外对于STEAP3在心肌肥厚中的作用和分子机制尚无报道。因此,本研究从动物、细胞、转录组学的角度探索了STEAP3对心肌肥厚的影响,并通过转录组学分析、信号通路分析及蛋白互作筛选等对STEAP3影响心肌肥厚的分子机制进行了系统研究。
(一)通过主动脉缩窄(TAC)手术构建小鼠心肌肥厚模型,并通过苯肾上腺素(PE)刺激新生大鼠心肌细胞诱导建立体外心肌肥厚细胞模型,结果发现,与假手术(Sham)对照组相比,STEAP3在TAC手术诱导的小鼠中以及PE刺激诱导的新生大鼠心肌细胞中表达下调,提示STEAP3很可能参与了心肌肥厚的发生发展。
(二)将离体培养的新生大鼠原代心肌细胞(NRCM )感染重组腺病毒AdshSTEAP3,NRCM中STEAP3表达显著降低提示腺病毒转染成功;然后给予PE刺激构建心肌细胞肥大模型,经免疫荧光染色及心肌细胞表面积分析发现,与对照组相比,STEAP3敲低使得心肌细胞明显增大,且心肌肥大标志物ANP和Myh7的mRNA水平差异显著;以上结果提示STEAP3可通过直接调节心肌细胞来抑制PE诱导的心肌肥厚。
(三)通过TAC手术建立压力超负荷诱导的STEAP3基因敲除(STEAP3-KO)小鼠心肌肥厚模型,并对各组小鼠进行心脏功能及组织形态学分析发现,与WT-TAC小鼠相比,STEAP3-KO-TAC小鼠显示出明显的心脏扩张、心肌收缩力降低和心功能恶化,且心脏纤维化的程度增加;与WT-Sham组小鼠相比,STEAP3-KO-Sham组的心脏功能及组织形态并没有发生明显变化,提示STEAP3基因敲除并没有导致心脏的病理改变,而是在压力超负荷诱导的心肌肥厚过程中加剧了心脏肥大和纤维化的程度。
(四)对TAC手术诱导的STEAP3-KO小鼠心肌肥厚模型的心脏组织进行转录组学分析,发现与WT-TAC对照组小鼠相比,STEAP3-KO-TAC组小鼠心脏中394个基因被上调,而363个基因被下调。差异基因层次聚类分析和qPCR验证结果显示,STEAP3基因敲除引起显著的转录重编程,STEAP3基因敲除后心肌肥厚及心脏纤维化相关的基因表达显著上调,心肌肥厚标志物ANP、BNP、Myh7以及心脏纤维化标志物Col1a1、Col3a1、Ctgf的mRNA水平显著上调;此外,STEAP3基因敲除后心脏中蛋白质合成相关基因的表达升高;以上研究提示STEAP3基因敲除促进心肌肥厚及纤维化相关基因的表达及蛋白质的合成。
(五)为了明确STEAP3调控病理性心肌肥厚的下游信号通路,我们进一步对STEAP3-KO组和WT组小鼠TAC手术后心脏转录组差异基因进行KEGG信号通路富集分析,发现STEAP3-KO组中MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路等心肌肥厚相关通路显著改变。Westernblot结果显示,同WT和STEAP3-KO假手术组相比,WT和STEAP3-KO组小鼠在TAC手术4周后的MAPK信号通路关键激酶MEK1/2、ERK1/2、JNK1/2和p38的磷酸化水平明显升高,提示病理性心肌肥厚中MAPK处于激活状态。与WT组相比,STEAP3基因敲除显著增加了MEK1/2和ERK1/2磷酸化激活,而不影响JNK1/2和p38的磷酸化激活。为进一步验证心肌细胞中STEAP3对MAPK信号通路的调控作用,我们通过腺病毒AdshSTEAP3在NRCM中干涉敲低STEAP3,并利用苯肾上腺素(PE)刺激心肌细胞,建立体外心肌细胞肥大模型。同小鼠体内结果一致,STEAP3敲低促进了PE诱导后MEK1/2和ERK1/2的磷酸化激活。以上结果提示,STEAP3可通过抑制心肌细胞内MAPK信号通路的MEK1/2-ERK1/2信号传导来调控心肌肥厚发生。
(六)通过免疫共沉淀富集STEAP3互作蛋白质复合物,并采用质谱检测,结果发现Rac1是STEAP3的潜在作用靶标。通过细胞外GST-pulldown实验和细胞内Co-IP实验得以验证。激光共聚焦显微镜观察到STEAP3和Rac1主要在细胞质中共定位,表明STEAP3可直接与Rac1在细胞质相互作用。免疫共沉淀实验表明,Rac1的大多数区域包括Rac1的C端区域(Rac1Δ162-192aa)和Rac1的插入区域(Rac1Δ124-135aa)与STEAP3相互作用。
(七)在腺病毒干涉敲低STEAP3的NRCM细胞中加入Rac1抑制剂NGC23766,抑制Rac1的激活阻断了PE刺激诱导的MEK1/2-ERK1/2激活,同时也逆转了敲低STEAP3对MEK1/2-ERK1/2激活作用。此外,在NRCM中过表达Rac1(G12V)的组成型持续性激活突变体,显著激活了MEK1/2和ERK1/2,并且大大减弱过表达STEAP3对MEK1/2-ERK1/2激活的抑制作用。此外,对NRCM细胞免疫荧光检测显示STEAP3对心肌细胞肥大的保护作用被Rac1(G12V)过表达明显抑制,同时Rac1(G12V)显著增加了心肌肥厚标志物ANP和Myh7的mRNA水平,阻断了STEAP3过表达对这些肥厚标志物基因的抑制作用。以上研究表明STEAP3对MEK/ERK信号传导途径的激活的抑制作用主要依赖于Rac1。
综上所述,我们通过体内和体外实验、转录组学分析发现并证实了STEAP3缺失促进心肌肥厚的发生发展,进一步分析验证发现STEAP3通过MAPK信号通路调控心肌肥厚。通过蛋白质互作组学分析和分子生物学验证发现了STEAP3通过直接调控Rac1,抑制MEK1/2-ERK1/2信号通路来抑制心肌细胞肥大和心肌肥厚。本研究拓宽了我们对STEAP3影响心肌肥大分子机制的理解,并提示靶向STEAP3可能是病理性心肌肥厚治疗的有效治疗策略。
前列腺六次跨膜蛋白3(STEAP3)作为一种金属还原酶,在维持人体铁稳态方面发挥着重要作用,并参与调控细胞的增殖、凋亡、炎症、纤维化等重要生物学事件。STEAP3在细胞内调控的信号通路和铁稳态均与心肌肥厚的发生发展机制密切相关。然而,目前国内外对于STEAP3在心肌肥厚中的作用和分子机制尚无报道。因此,本研究从动物、细胞、转录组学的角度探索了STEAP3对心肌肥厚的影响,并通过转录组学分析、信号通路分析及蛋白互作筛选等对STEAP3影响心肌肥厚的分子机制进行了系统研究。
(一)通过主动脉缩窄(TAC)手术构建小鼠心肌肥厚模型,并通过苯肾上腺素(PE)刺激新生大鼠心肌细胞诱导建立体外心肌肥厚细胞模型,结果发现,与假手术(Sham)对照组相比,STEAP3在TAC手术诱导的小鼠中以及PE刺激诱导的新生大鼠心肌细胞中表达下调,提示STEAP3很可能参与了心肌肥厚的发生发展。
(二)将离体培养的新生大鼠原代心肌细胞(NRCM )感染重组腺病毒AdshSTEAP3,NRCM中STEAP3表达显著降低提示腺病毒转染成功;然后给予PE刺激构建心肌细胞肥大模型,经免疫荧光染色及心肌细胞表面积分析发现,与对照组相比,STEAP3敲低使得心肌细胞明显增大,且心肌肥大标志物ANP和Myh7的mRNA水平差异显著;以上结果提示STEAP3可通过直接调节心肌细胞来抑制PE诱导的心肌肥厚。
(三)通过TAC手术建立压力超负荷诱导的STEAP3基因敲除(STEAP3-KO)小鼠心肌肥厚模型,并对各组小鼠进行心脏功能及组织形态学分析发现,与WT-TAC小鼠相比,STEAP3-KO-TAC小鼠显示出明显的心脏扩张、心肌收缩力降低和心功能恶化,且心脏纤维化的程度增加;与WT-Sham组小鼠相比,STEAP3-KO-Sham组的心脏功能及组织形态并没有发生明显变化,提示STEAP3基因敲除并没有导致心脏的病理改变,而是在压力超负荷诱导的心肌肥厚过程中加剧了心脏肥大和纤维化的程度。
(四)对TAC手术诱导的STEAP3-KO小鼠心肌肥厚模型的心脏组织进行转录组学分析,发现与WT-TAC对照组小鼠相比,STEAP3-KO-TAC组小鼠心脏中394个基因被上调,而363个基因被下调。差异基因层次聚类分析和qPCR验证结果显示,STEAP3基因敲除引起显著的转录重编程,STEAP3基因敲除后心肌肥厚及心脏纤维化相关的基因表达显著上调,心肌肥厚标志物ANP、BNP、Myh7以及心脏纤维化标志物Col1a1、Col3a1、Ctgf的mRNA水平显著上调;此外,STEAP3基因敲除后心脏中蛋白质合成相关基因的表达升高;以上研究提示STEAP3基因敲除促进心肌肥厚及纤维化相关基因的表达及蛋白质的合成。
(五)为了明确STEAP3调控病理性心肌肥厚的下游信号通路,我们进一步对STEAP3-KO组和WT组小鼠TAC手术后心脏转录组差异基因进行KEGG信号通路富集分析,发现STEAP3-KO组中MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路等心肌肥厚相关通路显著改变。Westernblot结果显示,同WT和STEAP3-KO假手术组相比,WT和STEAP3-KO组小鼠在TAC手术4周后的MAPK信号通路关键激酶MEK1/2、ERK1/2、JNK1/2和p38的磷酸化水平明显升高,提示病理性心肌肥厚中MAPK处于激活状态。与WT组相比,STEAP3基因敲除显著增加了MEK1/2和ERK1/2磷酸化激活,而不影响JNK1/2和p38的磷酸化激活。为进一步验证心肌细胞中STEAP3对MAPK信号通路的调控作用,我们通过腺病毒AdshSTEAP3在NRCM中干涉敲低STEAP3,并利用苯肾上腺素(PE)刺激心肌细胞,建立体外心肌细胞肥大模型。同小鼠体内结果一致,STEAP3敲低促进了PE诱导后MEK1/2和ERK1/2的磷酸化激活。以上结果提示,STEAP3可通过抑制心肌细胞内MAPK信号通路的MEK1/2-ERK1/2信号传导来调控心肌肥厚发生。
(六)通过免疫共沉淀富集STEAP3互作蛋白质复合物,并采用质谱检测,结果发现Rac1是STEAP3的潜在作用靶标。通过细胞外GST-pulldown实验和细胞内Co-IP实验得以验证。激光共聚焦显微镜观察到STEAP3和Rac1主要在细胞质中共定位,表明STEAP3可直接与Rac1在细胞质相互作用。免疫共沉淀实验表明,Rac1的大多数区域包括Rac1的C端区域(Rac1Δ162-192aa)和Rac1的插入区域(Rac1Δ124-135aa)与STEAP3相互作用。
(七)在腺病毒干涉敲低STEAP3的NRCM细胞中加入Rac1抑制剂NGC23766,抑制Rac1的激活阻断了PE刺激诱导的MEK1/2-ERK1/2激活,同时也逆转了敲低STEAP3对MEK1/2-ERK1/2激活作用。此外,在NRCM中过表达Rac1(G12V)的组成型持续性激活突变体,显著激活了MEK1/2和ERK1/2,并且大大减弱过表达STEAP3对MEK1/2-ERK1/2激活的抑制作用。此外,对NRCM细胞免疫荧光检测显示STEAP3对心肌细胞肥大的保护作用被Rac1(G12V)过表达明显抑制,同时Rac1(G12V)显著增加了心肌肥厚标志物ANP和Myh7的mRNA水平,阻断了STEAP3过表达对这些肥厚标志物基因的抑制作用。以上研究表明STEAP3对MEK/ERK信号传导途径的激活的抑制作用主要依赖于Rac1。
综上所述,我们通过体内和体外实验、转录组学分析发现并证实了STEAP3缺失促进心肌肥厚的发生发展,进一步分析验证发现STEAP3通过MAPK信号通路调控心肌肥厚。通过蛋白质互作组学分析和分子生物学验证发现了STEAP3通过直接调控Rac1,抑制MEK1/2-ERK1/2信号通路来抑制心肌细胞肥大和心肌肥厚。本研究拓宽了我们对STEAP3影响心肌肥大分子机制的理解,并提示靶向STEAP3可能是病理性心肌肥厚治疗的有效治疗策略。