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研究目的:视神经脊髓炎（Neuromyelitis optica,NMO）谱系疾病（Neuromyelitis optica spectrum disorders,NMOSD）是一种中枢神经系统（Central nervous system,CNS）自身反应性炎性脱髓鞘疾病,主要累及脊髓和视神经,还可累及脑实质。研究表明NMO的主要病理特征为水通道蛋白-4（Aquaporin 4,AQP4）自身抗体（AQP4-immunoglobulin G,AQP4-IgG）结合星形胶质细胞表面的AQP4后,激活补体,导致一系列炎症反应,造成星形胶质细胞丢失、少突神经胶质细胞受损和神经元死亡。目前NMO的治疗方式主要是免疫调节及血浆置换,但患者仍有较高的死亡率或严重的后遗症。单克隆抗体用于治疗NMO正受到越来越多的关注,例如,利妥昔单抗（Rituximab）、依库珠单抗（Eculizumab）和托珠单抗（Tocilizumab）等单克隆抗体药物已经进入临床试验阶段,部分抗体药物已经展现出较好的临床效果。但是,当前开展临床试验的该类药物多数为鼠源的单克隆抗体,长期应用有引起患者的人抗鼠免疫原性反应（Human anti-mouse anti-antibody,HAMA）的潜在风险。本研究的目的是通过体外噬菌体展示技术从全人源单链抗体库中筛选出能够特异性结合补体C5（Complement C5,C5）的单链抗体（Single-chain variable fragment,scFv）,并明确其对NMO疾病模型的治疗效果。研究方法:本研究利用噬菌体展示体外固相筛选技术从噬菌体抗体库(6×1010)中筛选能够特异性结合C5的单链抗体。经过5轮的筛选（吸附-洗脱-扩增）,随机挑选了239个噬菌体克隆,通过酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）验证其与补体C5的结合能力和结合特异性。根据ELISA多次重复的实验结果,选择在A450 nm数值较高的部分克隆进行核酸序列测定,使用DNAMAN进行序列多样性分析和序列比对,确定重复序列较高的阳性克隆。将重复序列最高的3个基因插入到原核表达载体pET30a（带有his标签）中。在低温（16°C）条件下培养,使用异丙基硫代半乳糖苷（Isopropylβ-D-Thiogalactoside,简称IPTG）诱导单链抗体基因在大肠杆菌BL21中可溶性表达。离心收集菌体后进行蛋白纯化,经过亲和层析、DEAE层析、Butyl层析一系列的纯化得到纯度在90%以上的可溶性单链抗体;用超滤管浓缩蛋白浓度至40 mg/mL用于后续实验;通过SDS-PAGE变性胶观察蛋白的片段大小,应用Western Blot、ELISA法鉴定可溶性单链抗体与补体C5结合的特异性;进一步用Biacore T200进行单链抗体与C5结合的亲和力和浓度依赖情况的检测,从而确定单链抗体的亲和力与补体C5的结合情况。挑选特异性较好的单链抗体作用于NMO体外和动物实验模型以明确目标单链抗体对NMO的治疗效果:利用AQP4-IgG和人补体（human complement,hC）作用于稳定表达AQP4的中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamsters ovary,CHO）模拟NMO的体外实验模型,通过LIVE/DEAD染色的方法验证筛选得到的单链抗体对NMO细胞模型细胞毒性的影响;选择脑实质注射NMOSD血清阳性患者的抗体(IgGNMOSD)和人补体在体内模拟视神经脊髓炎的发病情况,通过相关组织染色确定病灶及炎症细胞的变化,并进一步明确筛选得到的单链抗体对NMO的保护效果。结果:1.经过5轮噬菌体筛选得到了8个抗体序列（C5B3、C5B35、C5B98、C5B106、C5A6、C5A102、C5A121、C5A152）。将同源性最高的3个序列原核表达后进行一系列纯化,获得了纯度在90%以上的可溶性单链抗体。2.对纯化后的可溶性单链抗体（C5B3、C5A6、C5B35）进行了体外功能验证。结果表明,C5B3明显减少了稳定表达AQP4的CHO细胞的补体依赖性的细胞毒性作用,明显减少了膜攻击复合物的形成及死亡细胞的数量,且该作用具有明显的C5B3浓度依赖性。3.对单链抗体C5B3进行了体内功能验证。在NMO动物模型中,C5B3明显减小了脑实质注射IgGNMOSD和人补体引起的病灶体积和炎症细胞的浸润,并且能够减少体内膜攻击复合物的形成。结论:通过对全人源性噬菌体抗体库的筛选获得了特异性结合补体C5的单链抗体,经过体外及体内实验证实得到的1个单链抗体（C5B3）能够减少AQP4-IgG和人补体造成的细胞毒性,对NMO动物模型也能发挥一定的保护作用。