论文部分内容阅读
目的:研究安罗替尼联合Tspan8敲除对结肠癌SW480细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的影响,并探讨其可能的机制。方法:1.收集在我院行外科手术切除且经病理确诊为结肠癌患者的癌组织以及正常组织,采用蛋白质免疫印迹法检测其中Tspan8的表达情况。2.采用蛋白质免疫印迹法检测结肠癌SW480、HCT116和HT29细胞中Tspan8的表达水平,挑选Tspan8表达量最高的结肠癌细胞株用于后续实验。3.在NCBI中查询并拷贝Tspan8的基因序列,应用规律呈簇的间隔短回文重复/CRISPR相关核酸酶9（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9,CRISPR/Cas9）技术在线设计三条单向导RNA（single guide RNA,sg RNA）序列,并与lenti-CRISPR v2载体连接重组,成功构建Tspan8敲除质粒;通过Lipofectamine TM2000将Tspan8敲除质粒共转染至HEK293T工具细胞,成功制备Tspan8慢病毒;使用Tspan8慢病毒感染结肠癌SW480细胞,采用蛋白质免疫印迹法检测各组结肠癌SW480细胞中Tspan8的表达水平,筛选敲除效果最佳的细胞珠用于后续实验。4.采用MTT比色法检测不同浓度（0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64和128μmol/L）安罗替尼处理结肠癌SW480细胞不同时间（24,48和72小时（hour,h））后的细胞增殖情况,并计算半数抑制浓度（half inhibitory concentration,IC50）,以确定后续实验药物浓度。5.将实验分为对照组、安罗替尼组、Tspan8敲除组、安罗替尼+Tspan8敲除组。采用MTT比色法进行各组结肠癌SW480细胞增殖能力的检测;采用克隆形成实验进行各组结肠癌SW480细胞克隆形成能力的检测;采用划痕修复实验和Transwell小室法进行各组结肠癌SW480细胞迁移能力和侵袭能力的检测;采用流式细胞凋亡术进行各组结肠癌SW480细胞凋亡水平的检测。6.采用蛋白质免疫印迹法检测安罗替尼对结肠癌SW480细胞中Tspan8表达水平的影响。结果:1.蛋白质免疫印迹法结果显示:结肠癌患者的癌组织中Tspan8的表达水平显著高于正常组织（p＜0.01）。2.蛋白质免疫印迹法结果显示:3组结肠癌细胞中Tspan8的表达水平从高到低依次为:SW480＞HT29＞HCT116。与HT29和HCT116细胞相比,SW480细胞的Tspan8表达量最高（p＜0.05）。因此选择结肠癌SW480细胞用于后续实验。3.阳性克隆测序结果显示:3条针对Tspan8基因的sg RNA序列均成功正确插入lenti-CRISPR v2载体,表明3个Tspan8敲除质粒构建成功。4.蛋白质免疫印迹法结果显示:各组结肠癌SW480细胞中Tspan8的表达水平从高到低依次为:SW480-WT＞SW480-KO-Ⅰ＞SW480-KO-Ⅱ＞SW480-KO-Ⅲ。与SW480-WT、SW480-KO-Ⅰ、SW480-KO-Ⅱ细胞相比,SW480-KO-Ⅲ细胞的Tspan8表达量显著降低（p＜0.01）。因此选择敲除效果最佳的结肠癌SW480-KO-Ⅲ细胞进行后续实验。5.MTT比色法结果显示:安罗替尼在不同作用浓度和不同作用时间均能抑制结肠癌SW480细胞的增殖能力（p＜0.01）,且随着安罗替尼作用浓度的增大和作用时间的延长,细胞增殖抑制率明显增加（p＜0.01）;根据IC50选择14μmol/L为后续实验药物浓度。细胞增殖实验结果显示:与对照组相比,安罗替尼组、Tspan8敲除组和安罗替尼+Tspan8敲除组结肠癌SW480细胞的体外增殖能力明显受抑（p＜0.01）,且安罗替尼+Tspan8敲除组的细胞增殖速度在2、3和4天（day,d）明显低于安罗替尼组（p＜0.01）,但在1d时两组数据比较差异无统计学意义（p＞0.05）,而安罗替尼+Tspan8敲除组的细胞增殖速度整体低于Tspan8敲除组,仅在1d和2d时差异明显（p＜0.01）,但在3d和4d时两组数据比较差异无统计学意义（p＞0.05）。6.克隆形成实验结果显示:与对照组相比,安罗替尼组、Tspan8敲除组和安罗替尼+Tspan8敲除组结肠癌SW480细胞的克隆形成能力明显下降（p＜0.01）,且安罗替尼+Tspan8敲除组的细胞克隆形成能力下降水平较安罗替尼组（p＜0.01）更为显著,而与Tspan8敲除组相比,安罗替尼+Tspan8敲除组的水平更低,但两组数据比较差异无统计学意义（p＞0.05）。7.划痕修复实验结果显示:与对照组相比,安罗替尼组、Tspan8敲除组和安罗替尼+Tspan8敲除组结肠癌SW480细胞的迁移能力明显下降（p＜0.01）,且安罗替尼+Tspan8敲除组的细胞迁移抑制作用较安罗替尼组和Tspan8敲除组更为显著（p＜0.01）。8.Transwell小室法结果显示:与对照组相比,安罗替尼组、Tspan8敲除组和安罗替尼+Tspan8敲除组结肠癌SW480细胞的迁移和侵袭能力明显下降（p＜0.01）,且安罗替尼+Tspan8敲除组的细胞迁移和侵袭抑制作用较安罗替尼组和Tspan8敲除组更为显著（p＜0.01）。9.流式细胞凋亡术结果显示:与对照组相比,安罗替尼组、Tspan8敲除组和安罗替尼+Tspan8敲除组结肠癌SW480细胞的凋亡水平明显提高（p＜0.01）,且安罗替尼+Tspan8敲除组的细胞凋亡水平较安罗替尼组和Tspan8敲除组更高（p＜0.01）。10.蛋白质免疫印迹法结果显示:安罗替尼能使结肠癌SW480细胞的Tspan8表达水平明显下降（p＜0.01）。结论:安罗替尼联合Tspan8敲除能显著抑制结肠癌SW480细胞的增殖、迁移侵袭,并促进其凋亡。