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研究目的探索周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)在早产儿视网膜病变,糖尿病视网膜病变等视网膜新生血管疾病中的作用及作用机制,为防治视网膜新生血管相关疾病寻找新靶点。研究方法选取健康C57BL/6J小鼠36只,随机分为对照组与实验组,每组18只,将实验组小鼠利用氧诱导的方法构建OIR小鼠模型。使用GS-IB4荧光染色技术对小鼠视网膜进行染色,观察视网膜新生血管的情况,验证OIR小鼠模型是否构建成功。构建糖尿病视网膜病变小鼠模型。选取6～8周龄C57BL/6J小鼠36只,体质量18～22g,对照组18只,实验组18只,将实验组小鼠使用低剂量连续注射链脲佐菌素(STZ)的方法构建I型糖尿病小鼠模型,并喂养5个月,使用视网膜组织切片HE染色以及伊文思蓝灌注血管造影的方法,通关观察视网膜血管闭塞、渗漏以及视网膜新生血管等特征鉴定小鼠糖尿病视网膜病变模型的构建成功与否。利用免疫荧光、免疫组织化学染色的方法观察CDK1在小鼠视网膜中表达情况,利用蛋白免疫印迹法(Western Blot)和实时荧光反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测小鼠视网膜中CDK1表达情况,以验证CDK1在体内视网膜新生血管中的作用。构建CDK1小干扰RNA(对照组si NC,实验组si CDK1-1,si CDK1-2),将小干扰RNA转染至人脐静脉内皮细胞,并通过Western Blot和RT-PCR的方法检测在HUVECs中CDK1表达量,验证其转染效果。利用Ed U细胞增殖实验、Transwell细胞迁移实验与Matrigel基质胶管样形成实验方法检测si CDK1对HUVECs的功能影响。使用流式细胞仪检测si CDK1对HUVECs细胞周期的作用,并利用Western Blot与RT-PCR的方法检测细胞周期相关蛋白的表达水平;使用流式细胞仪检测si CDK1对HUVECs细胞凋亡的影响,并利用Western Blot与RT-PCR的方法检测细胞凋亡相关蛋白表达水平,探讨CDK1对HUVECs的作用机制。研究结果1.成功构建OIR小鼠模型。与正常小鼠视网膜相比,OIR小鼠模型中GS-IB4荧光染色可见视网膜出现高荧光新生血管区,新生血管分层不清,走行迂曲,分布杂乱。2.成功构建小鼠糖尿病视网膜病变模型。与对照组相比,实验组小鼠血糖明显升高,均高于16.5mmol/L,差异具有统计学意义(p<0.05);实验组小鼠喂养5个月后发现视网膜全层变薄,内核层及外核层细胞排列紊乱,血管走行迂曲,见血管闭塞,血管渗漏,可见少量视网膜新生血管。3.CDK1在小鼠视网膜新生血管中表达增加。免疫荧光可见CDK1在OIR小鼠视网膜中高表达,Western blot与RT-PCR结果显示CDK1的基因与蛋白水平表达水平明显升高,差异具有统计学意义,p<0.001。4.CDK1在糖尿病视网膜病变小鼠视网膜中高表达。免疫组织化学染色可见CDK1在糖尿病视网膜病变小鼠视网膜中高表达,Western blot与RT-PCR结果显示CDK1的基因与蛋白表达水平明显升高,差异具有统计学意义,p<0.01。5.siCDK1抑制HUVECs增殖、迁移和管样形成功能。Western blot与RT-PCR结果显示si CDK1转染组HUVECs同对照组相比,CDK1的基因与蛋白表达水平均降低(si CDK1-1,p<0.01;si CDK1-2,p<0.01)。Ed U实验结果显示si CDK1干预组HUVECs细胞增殖量明显下降(si CDK1-1,p<0.01;si CDK1-2,p<0.01);Transwell实验结果显示si CDK1干预组HUVECs细胞迁移量明显下降(si CDK1-1,p<0.01;si CDK1-2,p<0.01);基质胶管样形成实验显示si CDK1干预组HUVECs细胞管状结构明显减少(si CDK1-1,p<0.01;si CDK1-2,p<0.01)。6.低表达CDK1通过诱导G2/M细胞周期停滞、诱导细胞凋亡抑制视网膜新生血管的形成。流式细胞仪细胞周期结果显示,与阴性对照组HUVECs相比,si CDK1干预组细胞G2/M期细胞增加约10%;流式细胞仪细胞凋亡结果显示,与阴性对照组HUVECs相比,si CDK1干预组早期与晚期凋亡细胞增加约9%。Western Blot与RT-PCR结果显示si CDK1干预组HUVECs与对照组相比,cyclin B,cyclin D和CDK2等细胞周期相关分子表达水平降低(si CDK1-1,p<0.01;si CDK1-2,p<0.01);PARP,p21和p53等细胞凋亡相关分子表达水平增加(si CDK1-1,p<0.01;si CDK1-2,p<0.01)。研究结论CDK1在小鼠视网膜新生血管中高表达,降低CDK1表达可通过诱导细胞周期阻滞及诱导细胞凋亡抑制血管内皮细胞增殖,细胞迁移以及细胞管样形成,从而抑制视网膜新生血管形成。