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在硬骨鱼类中,卵子发生的过程可以分为原始生殖细胞形成期、卵原细胞形成期、卵母细胞形成期、卵母细胞生长期、卵母细胞成熟期、排卵期。众所周知,17α,20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one（17α,20β-DP,DHP）为鱼类特有的一种孕激素,其通过与孕激素核受体（progesterone nuclear receptor,pgr）结合来调控鱼类排卵等多种生理过程。通过对尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）DHP合成酶基因和核受体pgr的个体发生检测发现,二者均在孵化后5天（days after hatching,dah）开始表达,暗示DHP-PGR信号通路可能在卵巢发育过程中发挥重要作用,但DHP是否参与早期卵巢发育过程,仍有待于进一步研究。因此,为进一步阐明DHP在罗非鱼生殖过程中的重要作用,在pgr基因纯合突变系的基础上,进一步通过组织学、细胞学和分子生物学等手段,检测pgr突变在早期卵巢发育、生殖周期激素合成和排卵等过程中的影响,最终丰富我们对孕激素调控硬骨鱼类,乃至整个脊椎动物卵巢发育和雌性育性的理解和认识。本论文的主要研究结果如下:1.Pgr基因在雌性性腺中的细胞定位。原位杂交的结果表明在孵化后90天,pgr定位于卵巢的生殖细胞中。在成鱼阶段,pgr表达于卵黄发生前的卵母细胞和滤泡层的颗粒细胞中。2.Pgr基因突变对雌鱼性腺早期发育的影响。对30 dah,60 dah,90 dah的卵巢进行组织学检测,结果发现,在30 dah,60 dah,pgr纯合敲除雌鱼卵巢的生殖细胞数量比对照少。同时,在60 dah的对照雌鱼卵巢中可以发现大量II时相的卵母细胞存在,然而,pgr敲除卵巢中,大部分的卵母细胞都处于卵原细胞和I时相的卵母细胞阶段。另外,H.E.染色结果观察发现,pgr敲除雌鱼两侧性腺呈现出大量的体细胞和少量的生殖细胞。同时,Real-time PCR的结果与组织学观察结果一致,在60 dah,卵巢中vasa和42sp50的表达降低,说明pgr基因突变造成卵巢生殖细胞少。对类固醇合成通路基因检测发现,pgr敲除雌鱼性腺中St AR1,St AR2,cyp17a1和scc的表达量显著上调,同时,血清中检测到的睾酮（Testosterone,T）含量也显著高于对照组,雌激素合成相关基因的表达（cyp19a1a,foxl2）没有明显差异。卵巢发育到90 dah,从组织切片和Real-time PCR的结果来看,生殖细胞发育已经恢复正常。除了St AR1,其它类固醇合成相关基因基因（St AR2,scc,cyp17a1）的表达与对照相比已无明显差异。3.Pgr基因突变对成鱼卵母细胞成熟和排卵的影响。在360dah,对照雌鱼在实验室良好的饲养环境下可实现14天产一次卵,而pgr敲除雌鱼无产卵现象。与对照雌鱼不同,pgr敲除卵巢中存在大量白色坏死的卵母细胞,同时,性腺体重系数（gonadosomatic index,GSI）显著高于对照雌鱼。在540dah,由于大量的卵母细胞堆积,无法排出,pgr敲除雌鱼卵母细胞大量液化,整个性腺中充满了大量的绿色液体。通过人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin,h CG）体外处理实验发现,处理0h时,对照组和敲除组可见明显的生发泡存在;处理到24h时,对照组和敲除组都完成了生发泡破裂,表明卵母细胞已经成熟。但值得注意的是,此时对照组的卵母细胞排卵过程也已完成,而敲除组卵母细胞表现出排卵失败。上述结果表明,pgr基因敲除不会影响卵母细胞成熟,但会影响卵母细胞排卵过程。4.Pgr基因突变对生殖周期中激素合成和滤泡破裂的影响。众所周知,在实验室条件下,尼罗罗非鱼的平均产卵周期为14天,已有的观点认为,雌激素（17β-estradiol,E2）和DHP在鱼类卵母细胞生长,成熟和排卵过程中发挥着至关重要的作用。因此,我们收集了对照雌鱼和pgr纯合敲除雌鱼产卵周期中第3、8、12、14天的血清,检测其血清DHP以及E2的水平,结果表明,pgr敲除雌鱼DHP的含量都显著高于对照。值得一提的是,在产卵后第8天至14天之间,对照雌鱼血清DHP含量大幅升高并出现一个峰值,而敲除组中没有此峰存在,呈现DHP周期性波动缺失。另外,与DHP一样,pgr基因敲除也导致E2周期波动缺失。由于DHP的分泌受垂体释放的促性腺激素（luteinizing hormone,LH）的严密调控,通过Real-time PCR和荧光免疫组化检测发现,在pgr纯合敲除雌鱼垂体中lh基因的表达显著高于对照,这可能是pgr纯合敲除导致DHP水平升高的原因之一。除此以外,TUNEL染色结果发现,在对照组的滤泡层细胞中可以检测到明显的阳性信号,而敲除组未检测到阳性信号,说明pgr基因敲除导致卵母细胞滤泡层不能正常凋亡。同时,与对照相比,金属蛋白酶基因（matrix metalloproteinase,mmp）mmp2和mmp9的表达量也显著低于对照雌鱼,证明pgr敲除后滤泡层细胞破裂过程受到影响。综上,pgr基因敲除导致雌鱼产卵周期中激素合成紊乱,进一步影响滤泡层细胞的正常凋亡和破裂,最终导致排卵失败。综上所述,本研究通过对pgr基因敲除发现,在性腺发育早期,pgr缺失导致类固醇合成紊乱,引起卵巢卵母细胞数量减少,发育延迟。在成鱼时期,pgr基因敲除导致雌鱼DHP以及E2周期性波动信号缺失,进一步影响滤泡层凋亡和破裂,最终导致排卵失败。通过基因敲除模型,本研究首次探究了DHP-PGR信号通路在鱼类卵巢发育早期的重要作用。同时,通过对生殖周期中类固醇激素合成的探究,进一步揭示了孕激素-PGR信号通路影响排卵过程的可能机制。