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目的:神经母细胞瘤是一种恶性实体肿瘤,在儿童中常见。其中,神经母细胞瘤特异性的某些基因表达和增强子谱为神经母细胞瘤的分子生物学研究以及未来可能的靶向治疗提供基础。肿瘤细胞可以表达其自身的超级增强子,能够通过显著促进多种致病基因的表达,来维持肿瘤细胞自身的特性。因此,在上述研究基础上,本实验主要通过寻找在神经母细胞瘤中超级增强子调控的基因,研究其在神经母细胞瘤中发挥的作用,并尝试探寻其作用机制。研究方法:1.第一部分:TTC8在神经母细胞瘤中的表达情况及临床意义:利用生物信息学数据库中神经母细胞瘤细胞株组蛋白H3K27ac的ChIP-Seq结果分析在神经母细胞瘤中受超级增强子调控及具有重要意义的基因,并进行筛选鉴定;在Cancer Cell Line Encyclopedia（CCLE）生物信息学数据库中查询所筛选的基因TTC8在各种肿瘤细胞中的表达水平;在生物信息学数据库R2:Genomics Analysis and Visualization Platform中查询所筛选的基因TTC8在神经母细胞瘤患儿中,基因的表达水平和临床预后之间的关系。利用western-blot检测TTC8蛋白在多种肿瘤细胞中是否具有神经母细胞瘤的表达特异性。2.第二部分:敲低TTC8基因的表达后对神经母细胞瘤细胞生长、增殖、凋亡、黏附、迁移及侵袭能力的影响:首先设计与合成sh-NC及sh-TTC8基因干扰质粒,利用慢病毒包装转染神经母细胞瘤SK-N-BE2及IMR32,获得TTC8稳定敲低细胞株,随后利用RT-PCR、western-blot技术分别在基因及蛋白水平检测TTC8基因转录水平以及蛋白表达水平的敲低效率。利用CCK-8细胞增殖实验、克隆形成实验以及裸鼠的皮下成瘤实验来检测敲低TTC8基因后对SK-N-BE2及IMR32增殖能力的影响;流式细胞术检测敲低TTC8基因后对SK-N-BE2及IMR32凋亡水平的影响;Transwell实验及裸鼠肿瘤转移实验检测敲低TTC8基因后对SK-N-BE2及IMR32迁移及侵袭能力的影响;黏附实验检测敲低TTC8基因后对SK-N-BE2及IMR32黏附能力的影响。3.第三部分:TTC8在神经母细胞瘤中作用机制的研究及鉴定:首先利用慢病毒转染及RNA干扰技术,获得纯化的TTC8稳定敲低细胞株。收集sh-NC及sh-TTC8两组细胞的RNA,进行RNA-Seq检测,计算并筛选变化的基因及富集到的生物信号通路,并予以验证。利用生物信息学数据及软件对TTC8结合蛋白进行预测。随后利用蛋白质免疫共沉淀技术（Co-IP）对TTC8结合蛋白PHOX2B进行验证;利用免疫荧光技术对TTC8蛋白及PHOX2B蛋白共定位进行验证。利用western-blot技术检测TTC8蛋白对PHOX2B蛋白的影响。研究结果:1.第一部分:在神经母细胞瘤中,我们筛选出的TTC8基因为超级增强子调控的基因之一,并且其在神经母细胞瘤中具有较高的转录活性;CCLE数据显示,在多种肿瘤细胞的TTC8表达量中,神经母细胞瘤排在首位;R2-datebase数据显示,TTC8高表达的神经母细胞瘤患者预后较差。Western-blot结果显示在十余种肿瘤细胞株中,TTC8蛋白在神经母细胞瘤中特异性高表达。2.第二部分:成功构建TTC8基因稳定敲低表达的神经母细胞瘤细胞株:RT-PCR、western-blot结果显示,在基因及蛋白水平,TTC8基因敲低均较明显。CCK-8实验、克隆形成实验结果显示,与对照组相比,敲低TTC8基因的表达后,抑制了神经母细胞瘤细胞的增殖能力;裸鼠皮下成瘤实验结果显示,与对照组裸鼠相比,接种了 TTC8基因稳定敲低的神经母细胞瘤细胞后,肿瘤体积明显缩小;流式细胞术结果显示,与对照组相比,敲低TTC8基因的表达后,细胞凋亡率明显增加。Transwell实验及黏附实验结果显示,与对照组相比,敲低TTC8基因的表达后,神经母细胞瘤细胞的迁移、侵袭及黏附能力明显减弱;裸鼠肿瘤转移实验结果显示,与对照组裸鼠相比,接种了TTC8基因稳定敲低的神经母细胞瘤细胞后,裸鼠生存率明显上升,且肝脏、肾脏、脊柱等器官转移事件明显降低。3.第三部分:RNA-seq结果显示,敲低TTC8基因的表达后,通过KEGG分析,所富集到的通路主要为Focal adhesion等和细胞黏附、迁移侵袭等功能相关的信号通路。生物信息学数据及软件预测与TTC8结合的蛋白,包括PHOX2B等;Co-IP结果显示,TTC8蛋白与PHOX2B蛋白相互结合;免疫荧光结果显示,TTC8蛋白与PHOX2B蛋白存在一致定位,主要位于细胞质近核膜、以及少部分细胞核中;western-blot 结果显示,敲低 TTC8 蛋白的表达后,PHOX2B 蛋白的表达水平也显著下降。结论:1.TTC8基因在神经母细胞瘤中特异性高表达,并且受到超级增强子调控,其基因的转录水平和神经母细胞瘤患儿的临床预后呈负相关,因此TTC8在神经母细胞瘤中可能具有重要的研究价值。2.抑制TTC8的表达在体内及体外均可以抑制神经母细胞细胞的生长、增殖、迁移、侵袭以及黏附能力,并促进其细胞凋亡。3.TTC8基因参与调控神经母细胞瘤细胞的黏附、迁移以及细胞外基质信号传导等信号通路。4.TTC8蛋白可以与PHOX2B蛋白结合,可能促进其进入细胞核发挥作用,并维持其稳定性,防止其被降解。