背景与目的减少疟疾的传播是控制与消除疟疾的战略重点。配子体是疟原虫的有性繁殖形式,是患疟个体感染按蚊继而实现疟疾传播的关键。检测配子体可以为传播模型提供重要的数据,评估减少疟疾传播阶段的干预措施,并有助于预测人类对蚊子的潜在感染力。同时,田鼠巴贝斯虫是一种寄生虫形态、生活史,临床症状都和疟原虫相似的红细胞内寄生虫。两者在中国云南有相似的流行传播区,因而田鼠巴贝斯虫经常被误诊为耐药型疟疾而延误治疗。目前针对疟原虫配子体或田鼠巴贝斯虫的检测方法中,分子诊断法的灵敏度较高。但其中大多数需要首先进行核酸提取或逆转录的过程,易发生交叉污染或RNA降解从而导致假阳性或假阴性,此外成本高且费时费力,从而极大的限制了检测的通量。为了解决上述问题,本研究将开发一种简单快速且灵敏特异,高通量,适合于大规模筛查疟原虫配子体或田鼠巴贝斯虫的检测方法。方法本研究基于捕获与连接探针技术,结合qPCR探针法建立了无需核酸提取和逆转录,灵敏高通量的单重和多重筛查技术——基于捕获与连接探针的通用探针法（Capture and Ligation probe-PCR by TaqMan,CLIP-PCR-TaqMan）。其中,本研究针对恶性疟原虫和间日疟原虫的雌性配子体和田鼠巴贝斯虫开发了单重CLIP-PCR-TaqMan检测法,并与现有的RT-qPCR方法和标准CLIP-PCR染料法比较,评估本方法的灵敏度、特异性和重复性。此外,本研究确立了针对恶性疟原虫和间日疟原虫雄性配子体的最适检测靶标,并针对疟原虫的雌性和雄性配子体开发了多重CLIP-PCR-TaqMan检测法,评估了方法的灵敏度、特异性和重复性。通过检测恶性疟原虫培养品比较了上述方法与现有的RT-qPCR。最后将开发的方法用于云-缅边境疟疾流行区采集的血液样本的检测。结果本研究提出的基于捕获与连接的qPCR通用探针法可成功应用于恶性疟原虫和间日疟原虫雌性配子体的Pfs25和Pvs25 mRNA、以及田鼠巴贝斯虫18S rRNA转录本的单重检测。与CLIP-PCR染料法以及RT-qPCR相比,灵敏度基本一致,均能达到11 copies/reaction,重复性和特异性良好。其中,与RT-qPCR相比操作更简便,免核酸提取和逆转录,3个小时内可高通量检测96个样本。此外,在田鼠巴贝斯虫可疑样本的检测中,通过pooling的方法捕获,3小时内可在一块96孔板中完成576份样本的筛查。其次,与CLIP-PCR染料法相比,探针法检测更有实现多重检测的潜力。同时,本研究中找到了间日疟原虫雄性配子体中特异性表达量最高的转录本Pv-MSSP mRNA,作为雄性配子体的检测靶标。并且本研究开发了针对两种疟原虫雌雄配子体的两重检测法,CLIP-PCR-TaqMan多重检测恶性疟原虫雌雄配子体的检测下限分别为65 copies和22 copies,多重检测间日疟雌雄配子体检测下限为22 copies和20 copies。与RT-qPCR相比,检测雌性信号明显高于雄性的恶性疟培养样本,多重CLIP-PCR-TaqMan得到的雌性和雄性配子体的信号更均一。另外,将多重检测应用于检测间日疟阳性临床样本,可在38例中筛查出8例雌雄双阳性,3例雄性单阳性,3例雌性单阳性,8例双阳性大部分也是雄性信号强于雌性信号,这将有利于在“雄少雌多”的自然状态下对雄性的检测。最后,筛查1440例来自疟疾流行区的田鼠巴贝斯虫可疑样本发现了一例阳性。结论本研究开发了基于捕获与连接探针的qPCR通用探针法,成功实现了免核酸提取及逆转录进行疟原虫雌雄配子体的单重和多重以及田鼠巴贝斯虫的定种高通量检测,并首次实现了对间日疟雄性配子体的检测,在实际应用中效果良好。