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目的:睫状神经营养因子(Ciliary Neurotrophic Factor ,CNTF )是一种可以促进多种神经元分化和存活,阻止神经元退变并保护神经元免受损伤的神经活性蛋白,1984年由Barbin等从鸡胚睫状体、脉络膜、虹膜中提取获得,因其能维持副交感神经节的存活并对睫状节神经元具有营养作用而得名。CNTF最突出的作用是维持中枢和周围运动神经元的生物活性,可以促进多种神经元的存活和分化,抑制神经元受损后的退变。正常大鼠的脊髓可以表达少量的CNTF,且损伤后在中枢及周围神经损伤局部会发生暂时性的表达上调,但其难以达到对抗神经损伤的水平。随着分子生物学和基因工程技术的快速发展,利用复制缺陷型重组腺病毒(Adenovirus,AdV)将编码神经营养因子的基因导入到靶细胞和组织中,以期得到稳定持久的表达已成为神经损伤修复领域新的研究方向。本实验将携带有CNTF的复制缺陷型腺病毒(AdCNTF)和不携带任何外源基因的复制缺陷型腺病毒(Ad0)分别导入大鼠脊髓腰膨大中,观察腺病毒介导的外源性CNTF基因在大鼠脊髓的表达水平,以探讨这一基因治疗新途径。方法:将7周龄、体重200-250g的健康Wistar大鼠126只随机分至三组当中。其中正常对照组(A组)42只,正常饲养不予处理;实验对照组(B组)42只,导入不携带外源基因的重组腺病毒载体Ad0;实验组(C组)42只导入携带外源性CNTF基因的重组腺病毒载体AdCNTF。腹腔注射10%水合氯醛麻醉,麻醉成功后将大鼠固定于立体定位仪上,切取长约2cm后正中纵切口,逐层切开并分离椎旁肌肉显露T13椎板及棘突,仔细咬除T13椎板后明胶海绵轻微压迫止血。微量注射器迅速吸取1μL病毒液,于T13脊髓后正中动脉稍偏右0.8mm处,斜向头端45°刺入,进针长度约2.5mm,缓慢推送1μL/min。实验对照组(B组)注入Ad0,实验组(C组)注入AdCNTF,完毕滞针2min后缓慢拔针。充分止血,生理盐水冲洗后局部应用抗生素,关闭伤口。三组大鼠在B、C组注射腺病毒后2天、7天、2周、4周、6周、8周、10周时取材。将同一时间点不同组别的wistar大鼠(6只)其中3只经多聚甲醛灌注后取出脊髓腰膨大节段。另外3只大鼠在麻醉后不进行灌注直接取出脊髓腰膨大节段,冻存于-70℃冰箱中留备RT-PCR实验之用。分别对三组大鼠不同时间点的脊髓灌注标本进行40μm连续振动切片,进行CNTF免疫组化实验,计数脊髓前角CNTF阳性细胞数目。对冻存标本进行RT-PCR实验,逆转录脊髓组织中的CNTFmRNA,并以β-actin为内参照,计算CNTFmRNA的相对表达量。所测数据使用SPSS 17.0统计软件处理,以x±s表示,首先对三组数据进行方差齐性检验,若方差齐同则应用LSD-t检验进行同一时间点组间两两比较,方差不齐采用Kruskal-Wills H检验, P<0.05为差异有统计学意义。结果:1 CNTF基因在大鼠脊髓中的表达趋势脊髓切片CNTF免疫组化检测显示A组(正常对照组)组内不同时间点阳性细胞计数比较均无显著差异(P>0.05),认为A组CNTF表达量不具有随时间变化的趋势;B组(实验对照组)手术导入脊髓空白腺病毒Ad0后第2天CNTF表达量增加,第7天达高峰,2周时CNTF降至正常水平,在第2周及以后时间点与A组(正常对照组)比较无显著差异(P>0.05);C组(实验组)在手术导入脊髓携带有CNTF基因的AdCNTF后第2天CNTF表达量增加,表达高峰同为第7天,此后逐渐下降,至第8周时降至正常水平,且C组的CNTF表达量在第2天、7天、2周、4周、6周时均高于同时间点B组和A组。统计分析显示:在手术导入腺病毒后第2天、7天,三组两两比较均有显著差异(P<0.05);在第2周、4周、6周,B、C组与A组(正常对照组)比较,C组与其有显著差异(p<0.05);在第8周、10周,三组两两比较均无显著差异(p>0.05)。2脊髓标本腺病毒PCR检测利用腺病毒特异性引物对腺病毒10×梯度稀释液中的DNA进行扩增,测出AdCNTF与Ad0具有共同的最低稀释度10~4。在不同时间点对B组(实验对照组)和C组(实验组)脊髓标本中腺病毒DNA进行检测,发现腺病毒DNA含量随时间下降,导入后第10周已测不到腺病毒DNA。3 CNTF mRNA表达趋势用逆转录PCR技术(RT-PCR)检测CNTF mRNA在正常对照组(A组)、实验对照组(B组)、实验组(C组)中的变化趋势:正常对照组(A组)存在低水平的CNTF mRNA表达,表达量不随时间变化;实验对照组(B组)在手术导入无外源基因的腺病毒Ad0 2天后,与同时间点正常对照组(A组)比较CNTF mRNA表达量增多,第7天达到高峰,2周时降至正常水平;实验组(C组)手术导入携带有CNTF基因的腺病毒AdCNTF后2天可检测到CNTF mRNA升高,表达高峰同为第7天,此后呈下降趋势,至第8周时降至正常水平。在第2天、7天、2周、4周、6周时C组CNTF mRNA表达量均高于同时间点实验对照组(B组)和正常对照组(A组)。统计分析显示:手术导入病毒后第2天、7天时三组两两比较均有显著差异(P<0.05),第2周、4周、6周时另两组与A组(正常对照组)比较,C组与其有显著差异(p<0.05),8周、10周时三组两两比较均无显著差异(p>0.05)。结论:正常大鼠脊髓组织中即存在低水平的内源性CNTF表达。大鼠脊髓在导入不携带外源基因的腺病毒Ad0后,内源性CNTF表达水平较正常大鼠短暂增高,这是由于腺病毒引起的炎性刺激、免疫反应及手术造模过程对脊髓造成了损伤。而在导入携带CNTF基因的AdCNTF后,外源性CNTF基因在大鼠脊髓组织内得到了高强度持久的表达。