食物过敏是影响全球数以百万计人口的重要健康问题之一。世界各国已出台相应的强制性政策要求食物制造商清楚标明可能存在的主要致敏食品成分,但在食品加工的任何环节都可能发生食品标签上未出现的过敏原对食品的无意污染,可能对过敏患者造成严重的健康威胁。因此,开发简单便携快速的过敏原检测方法,协助监管者和食品制造商进行有效评估和管理,降低致敏成分所带来的危害,保护敏感消费者,具有非常重要的意义。本课题选取核桃、榛子和花生等重要过敏原作为检测对象,针对两种极具发展潜力的新型恒温扩增技术分别开发适合的检测方法,使得恒温扩增技术便携快速的特点得到更大程度的发挥。主要研究内容和结果如下:（1）基于RPA的过敏原快速检测方法研究针对核桃和榛子两种过敏原,选用核桃5.8S r RNA基因和榛子Cora1基因作为目标设计了单重RPA扩增的引物,并从引物内部稳定性角度对RPA引物设计作了经验性总结,分别对单重RPA扩增的条件进行了优化,并在此基础上建立了双重RPA同时检测核桃和榛子的方法,结果表明:引物二聚体的形成是干扰RPA扩增最大的问题,二聚体形成ΔG的绝对值应＜4 kcal/mol,当二聚体形成于3’端时ΔG最大绝对值应＜3.4 kcal/mol,与PCR类似,5’ΔG明显高于3’ΔG则有利于降低非特异性扩增条带的产生;结合琼脂糖凝胶电泳,RPA扩增能够检测10 pg/μL的核桃或榛子基因组DNA,其灵敏度与传统PCR相当,但能够节省约46%的时间,更加快速简单;双重RPA体系同时检测核桃和榛子DNA时,其检测灵敏度为100 pg/μL,效果略逊于双重PCR方法,非特异性条带较多,因此,RPA具备双重检测过敏原核酸的潜力,但想要得到更理想的效果仍需进一步深入研究。另一方面,根据RPA反应的特点,提出分步离心的策略,设计了一种基于SYBR Green I染色无需开盖的荧光可视化过敏原检测方法,引物浓度和反应时间是影响该方法的关键因素,通过优化条件,使用0.24μmol/L引物扩增20 min后,添加1×SYBR Green I,即可获得色差值高达25的颜色对比差异,显色效果最佳。该荧光可视化方法无需开盖操作即可实现对过敏原的快速荧光可视化分析,适合现场分析,为过敏原的快速分析提供了新思路。（2）基于p H-LAMP的可视化检测方法研究针对核桃、榛子和花生三种过敏原,选用核桃2S种子贮存蛋白基因、榛子2S种子贮存蛋白基因和花生5.8S r RNA基因作为目标分别设计了3组LAMP引物,特异性识别目标序列的8/6个区域,利用LAMP扩增过程中H+不断积累并引起溶液p H发生改变的特点,通过添加p H指示剂甲酚红（CR）,建立了针对3种过敏原的3个基于CR染色的p H-LAMP体系,对比了CR染色法和实时荧光p H-LAMP的检测效果,结果表明,125μmol/L的CR添加量能够获得最优的检测效果,该方法能够最低检测1 ng/μL的核桃以及10 pg/μL的榛子或花生,与实时荧光法检测灵敏度相当。在以上研究基础上,利用颜色叠加原理,提出通过添加另外一种染料以叠加CR引起的颜色变化,增大可视化窗口、增强颜色变化对比度的方法,建立了基于羟基萘酚蓝（HNB）和CR的双重染料叠加的p H-LAMP可视化检测方法,结果表明,125μmol/L CR和50μmol/L HNB叠加得到的效果最好,叠加后可视化窗口增大将近一倍,且颜色对比度也更强,发生接近补色的颜色变化;能够检测1 ng/μL的核桃模板,10 pg/μL的榛子或花生模板,与实时荧光法灵敏度相当;对实际过敏原掺杂样品的检测结果也表明,该方法具有较好的特异性,能够检测掺杂1%的核桃,0.01%的榛子或花生。所建立的双重染料可视化检测方法具有与实时荧光法相当的检测灵敏度,同时具有更宽的可视化窗口以及更明显的颜色变化,可以拓展应用于其他可视化核酸分析。