【摘 要】
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黄毛草莓（Fragaria nilgerrensis Schlecht.ex Gay）,是我国西南地区广布的野生草莓资源,拥有独特的果色、果香,植株健壮且抽生能力和抗逆性强,是栽培草莓遗传改良的重要野生资源;但由于二者倍性不同,且遗传差异较大,故在常规杂交育种中选择效率低,子代优良性状难以集中。而基于植物原生质体分离和培养的体细胞杂交技术可实现科属种间杂交,并且原生质体也是遗传转化的理想工具。因此
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黄毛草莓（Fragaria nilgerrensis Schlecht.ex Gay）,是我国西南地区广布的野生草莓资源,拥有独特的果色、果香,植株健壮且抽生能力和抗逆性强,是栽培草莓遗传改良的重要野生资源;但由于二者倍性不同,且遗传差异较大,故在常规杂交育种中选择效率低,子代优良性状难以集中。而基于植物原生质体分离和培养的体细胞杂交技术可实现科属种间杂交,并且原生质体也是遗传转化的理想工具。因此,本研究建立品质优良的低倍性野生二倍体黄毛草莓原生质体分离体系,在此基础上,进行栽培草莓与野生黄毛草莓的体细胞融合探究,以克服杂交中出现的障碍以获得种间杂种,从而扩大无性系变异谱及突变体筛选来选育优良和特色品种;同时利用果实相关基因Fn MYB1构建黄毛草莓原生质体瞬时表达体系,为草莓后续深入开展细胞和分子生物学及其他基因组学研究提供理论和技术依据,也为开发利用我国野生草莓资源提供一条新途径。主要研究结果如下:1.草莓胚性愈伤组织诱导培养体系:适宜黄毛草莓茎尖诱导愈伤组织的培养基为MS+0.2 mg/L NAA+0.3 mg/L 2,4-D+0.4 mg/L TDZ+0.2 mg/L 6-BA,叶片诱导愈伤组织培养基为MS+0.6 mg/L NAA+0.3 mg/L 2,4-D+0.2 mg/L TDZ+0.6mg/L 6-BA,最佳暗处理时间为12 d;诱导出的愈伤组织能培养改造为胚性愈伤组织。三种栽培草莓花药愈伤组织诱导的最适预处理条件为4℃低温暗处理2 d,培养基为MS+1.0 mg/L 2,4-D+2.0 mg/L 6-BA,诱导叶片和匍匐茎段愈伤组织的培养基为0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA;花药和叶片诱导的愈伤组织能培养改造为胚性愈伤组织。2.黄毛草莓原生质体分离纯化体系:无菌叶片经预处理CPW 3M浸泡40min,使用1.2%Cellulase R-10+0.1%Pectolyase Y-23+0.6%Macerozyme R-10+0.5 M D-甘露醇或1.2%Cellulase R-10+0.15%Pectolyase Y-23+0.45%Macerozyme R-10+0.45 M D-甘露醇酶解液组合,黑暗条件35 rpm匀速酶解13h,1200 r/min纯化洗涤4 min,能得到数量和质量最佳的黄毛草莓叶肉原生质体;胚性愈伤组织经60 min低温预处理,使用1.1%Cellulase R-10+0.15%Pectolyase Y-23+0.45%Macerozyme R-10+0.45 M D-甘露醇酶解液组合,35 rpm黑暗酶解12 h,800 r/min纯化离心4 min能得到数量和质量最佳的黄毛草莓胚性愈伤组织原生质体。3.草莓原生质体融合:采用PEG结合高Ga2+高p H法,使用30%PEG 6000融合液和高Ga2+稀释液各作用25 min时,黄毛草莓和桃熏草莓叶肉原生质体融合率最高,为8.76%;使用30%PEG 6000和高Ga2+稀释液各处理15 min时,黄毛草莓胚性愈伤组织原生质体与桃熏草莓叶肉原生质体融合率最高,为9.89%。4.草莓原生质体培养:使用液体浅层培养法诱导出黄毛草莓叶肉原生质体愈伤组织,使用培养基为0.5 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+0.3 M葡萄糖,植板率最高为10.09%。5.黄毛草莓原生质体瞬时表达系统:选用黄毛草莓Fn MYB1基因,亚细胞定位该基因于细胞核上,与预测结果相同,成功构建原生质体瞬时表达体系。
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