目的:骨关节炎（osteoarthritis,OA）是最常见的慢性退行性关节疾病,是一种累及多个骨骼部位的全关节疾病,以膝关节最为严重,发病率逐年上升。OA的病理特征包括全关节软骨破坏、滑膜炎症、骨赘形成、软骨下骨硬化以及韧带和半月板退变。这些病理过程是导致关节僵硬和疼痛的主要原因,不仅导致活动受限和生活质量下降,而且还造成巨大的社会经济损失。尽管OA已有250多年的历史,但其进展的确切复杂分子机制仍不清楚。OA的发生发展与多种病理因素有关,如负荷过重、创伤、炎症系统失衡、抗炎途径受损等。目前,仍然没有有效解决关节退变和炎症的治疗方法,只有对症疗法旨在减轻疼痛,目前还没有全球批准的疾病改善药物来减缓骨关节炎的发病和进展。因此,关节置换往往是最后有效的治疗方法。细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是一种传递有丝分裂原信号的信号转导蛋白,属于丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）家族,在信号级联中发挥作用,将细胞外信号传递到细胞内靶点。因此,MAPK级联是调节细胞增殖、分化和应激反应等基本过程的中枢信号元件。这些级联通过三到五层蛋白激酶（MAP4K、MAP3K、MAPKK、MAPK和MAPK活化蛋白激酶（MAPKAPK））的顺序激活来传递信号。前三层中心被认为是一个基本的核心单位,而最后两层出现在一些级联。根据MAPK层的组成,已经定义了四种MAPK级联:ERK1/2、c-Jun n末端激酶（JNK）、p38 MAPK和ERK5。ERK级联是高度调节的级联,负责基本的细胞过程,包括细胞增殖和分化。这些调节因子影响双特异性磷酸酶、支架蛋白、信号持续时间和强度以及级联组分的动态亚细胞定位。由于ERK级联的重要性,ERK紊乱对细胞有害,最终对身体有害。MAPK信号通路参与OA的发生发展。炎性细胞因子如IL-1β可激活MAPK（ERK1/2、JNK1和p38）信号通路,导致分解代谢和炎症反应相关基因的表达。此外,MAPK的激活增加了转录因子如RUNX-2、HIF-2α和C/EBPβ的表达,从而进一步激活了NF-κB信号通路。NF-κB p65亚基被激活后移位到细胞核,参与调节基质降解酶和促炎因子的表达,影响细胞外基质的合成和重塑。TESC,也被称为Tescalcin或钙调神经磷酸酶B同源蛋白3（calcineurin B homologous protein 3,CHP3）,最初是在对小鼠胚胎睾丸进行分析时发现的,它包含一个EF-Hand基序,该基序具有一个钙结合蛋白超家族的特征,这些蛋白的成员在几个细胞过程中发挥关键作用。TESC直接与Na+/H+交换器相互作用,从而调节细胞质p H值。此外,TESC通过调节E26转化特异性转录因子的基因表达,在巨核细胞分化和成熟过程中发挥重要作用。最近的几份研究报告表明,细胞TESC的过度产生与几种类型的癌症及肿瘤的进展有关,包括辐射诱导的乳头状甲状腺癌、急性髓系白血病、肾细胞癌和人类结直肠癌。然而,TESC介导细胞的调控信号和机制还不是很清楚。在课题组前期工作的基础上,本课题首先建立体内、体外的SD大鼠关节软骨OA模型,验证SD大鼠膝关节OA软骨中TESC的表达变化以及TESC与关节软骨严重程度的相关性。其次利用腺病毒敲减SD大鼠原代软骨细胞TESC基因序列,观察OA关节软骨细胞的缓解程度,同样方法通过向大鼠膝关节腔注射腺病毒敲减软骨组织TESC基因序列,观察手术制造OA模型的SD大鼠膝关节软骨改善程度,以此来探究TESC在大鼠OA关节软骨中的作用。最后,利用ERK通路激活剂Honokiol,通过回复实验反复研究TESC对大鼠OA软骨细胞的作用机制。研究方法:1.利用NCBI GEO数据库表达谱芯片（GSE117999;GSE169077）分析TESC在正常关节软骨及OA关节软骨中的m RNA表达水平。2.提取SD大鼠原代软骨细胞并培养,应用大鼠重组IL-1β建立软骨细胞OA模型,所有细胞选择第1代软骨细胞。通过预设IL-1β作用的浓度梯度及时间梯度模型,观察SD大鼠原代软骨细胞中TESC及相关炎性分子在m RNA和蛋白质水平的表达变化,以及其与OA软骨细胞变性严重程度的相关性,并确定IL-1β的造模浓度及作用时间。3.通过行前十字韧带离断术（anterior cruciate ligament transection,ACLT）建立SD大鼠膝关节OA手术模型。运用组织化学染色法检测组织中TESC和相关炎性分子在蛋白质水平的表达变化。并与SD大鼠膝关节OA软骨变性严重程度的相关性。同时进行膝关节X线平片的拍摄及膝关节组织学评分,最终确定SD大鼠OA手术模型的造模时间。4.应用CCK-8实验观察空载腺病毒及带有TESC敲减基序腺病毒对软骨细胞活性及细胞毒性的影响。敲减SD大鼠原代软骨细胞TESC基因序列,制备软骨细胞OA模型,检测TESC m RNA和蛋白质的表达水平并以此验证敲减效率,同时检测相关炎性分子m RNA和蛋白质的表达水平探究TESC对OA关节软骨细胞的作用,并确定TESC敲减腺病毒的最优序列。5.敲减SD大鼠原代关节软骨细胞TESC基因序列,制备软骨细胞OA模型,应用免疫荧光检测TESC蛋白质的表达水平并进一步验证腺病毒敲减效率,同时检测相关炎性分子蛋白质的表达水平探究TESC对OA关节软骨细胞的作用。6.敲减SD大鼠原代关节软骨细胞TESC基因序列,制备软骨细胞OA模型,应用流式细胞术、q RT-PCR、WB对凋亡相关因子的检测,探究TESC对OA关节软骨细胞凋亡的影响及作用。7.造模前1周通过给予SD大鼠膝关节腔注射腺病毒敲减关节软骨TESC基因序列,然后行ACLT制备SD大鼠膝关节OA手术模型。通过免疫组织化学验证TESC腺病毒敲减效率,通过膝关节X线及组织学评分判断敲减TESC对OA的改善程度。通过对相关炎性因子的免疫组织化学染色探究TESC对OA关节软骨变性的作用。8.敲减SD大鼠原代关节软骨细胞TESC基因序列,制备软骨细胞OA模型,探究TESC对OA软骨细胞下游信号通路的影响,及应用ERK1/2通路激活剂Honokiol,利用回复实验,反向验证TESC与ERK1/2信号通路之间的关系。通过q RT-PCR、WB、免疫荧光对相关炎性分子的检测,观察软骨细胞变性的回复情况,通过流式细胞术及相关凋亡指标的检测,观察OA软骨细胞凋亡率的回复情况。结果:1.在大鼠重组IL-1β的刺激下,TESC在SD大鼠原代软骨细胞中的表达增加,并随着刺激浓度的升高,作用时间的延长,呈现正相关性。（1）分别用1ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml IL-1β刺激原代软骨细胞24h,模拟体外OA模型。（2）通过q RT-PCR、WB,我们发现软骨细胞呈炎性变化,COL2A1、AGGRECAN等代表合成代谢指标下降,MMP-3、MMP-13等代表分解代谢指标上升,并随着IL-1β浓度升高,变化增大,并在1ng/ml浓度下变化发生显著差异。TESC的m RNA和蛋白质表达水平随着IL-1β浓度升高而增高,并在1ng/ml浓度下变化发生显著差异。（3）用1ng/ml IL-1β刺激原代软骨细胞6h、12h、24h,模拟体外OA模型。（4）通过q RT-PCR、WB,我们发现软骨细胞呈炎性变化,COL2A1、AGGRECAN等代表合成代谢指标下降,MMP-3、MMP-13等代表分解代谢指标上升,并且随着IL-1β刺激时间的延长,变化增大,在作用24h时,变化差异最显著。TESC的m RNA和蛋白质表达水平随着IL-1β刺激时间延长,而增高,在作用24h时,变化差异最显著。2.在对SD大鼠膝关节行ACLT模拟OA手术模型中,TESC的蛋白表达水平随着造模时间的延长,呈正相关性。（1）通过离断SD大鼠膝关节前十字韧带模拟OA模型,分别对术后2、4、8周大鼠膝关节进行检测。（2）通过对SD大鼠膝关节X线平片及组织学评分分析,随着造模时间的延长,OA越严重。（3）通过对SD大鼠膝关节进行免疫组织化学染色,COL2A1、AGGRECAN等代表合成代谢指标下降,MMP-3、MMP-13等代表分解代谢指标上升,并随着造模时间的延长,变化增大,并且在术后4周,呈显著变化趋势。TESC的蛋白表达水平随着造模时间的延长,而增高,并且在术后4周,呈显著变化趋势。3.应用腺病毒敲减SD大鼠原代软骨细胞TESC基因序列,IL-1β（1ng/ml,24h）造模后,软骨细胞变性得以缓解。（1）通过q RT-PCR、WB、IF发现,SD大鼠原代软骨细胞TESC基因序列被成功敲低,敲减效率大于40%并通过CCK-8实验证明其对软骨细胞并无毒性及活性影响。（2）应用IL-1β模拟软骨细胞OA模型,通过q RT-PCR、WB、IF发现,敲减TESC后,COL2A1、AGGRECAN、MMP-3、MMP-13等指标的变化得以反转,分解代谢减少,合成代谢增加,缓解了OA软骨细胞变性。（3）通过流式细胞术及对相关凋亡因子的检测,敲减TESC后,SD大鼠原代软骨细胞凋亡率降低。4.应用腺病毒敲减SD大鼠膝关节关节软骨TESC基因序列,手术模型（ACLT,4w）建立后,关节软骨变性较对照组得以改善。（1）通过对SD大鼠膝关节进行免疫组织化学染色,TESC的蛋白表达水平明显降低,验证敲减成功。（2）通过对SD大鼠膝关节进行X线平片及组织学评分分析,OA得到改善。（3）通过对SD大鼠膝关节进行免疫组织化学染色,COL2A1、AGGRECAN、MMP-3、MMP-13等指标的变化得以反转,分解代谢减少,合成代谢增加,缓解了OA的关节软骨变性。5.在IL-1β的刺激下,敲减TESC的原代软骨细胞可通过减少ERK1/2信号通路的激活,降低软骨细胞的变性,并且在ERK1/2通路激活剂Honokiol的作用下,变性得到了回复。（1）在IL-1β（1ng/ml,24h）的刺激下,敲减TESC的原代软骨细胞ERK1/2磷酸化程度较对照组明显降低。（2）通过ERK1/2通路激活剂Honokiol的刺激,敲减TESC的原代软骨细胞ERK1/2磷酸化程度较对照组明显增加。（3）敲减TESC的原代软骨细胞受到Honokiol（5μM）的刺激后,COL2A1、AGGRECAN等代表合成代谢指标下降,MMP-3、MMP-13等代表分解代谢指标上升,变化趋势得以反转。（4）敲减TESC的原代软骨细胞受到Honokiol的刺激后,SD大鼠原代软骨细胞凋亡率增加。结论:1.通过应用IL-1β模拟SD大鼠软骨细胞的OA模型中,TESC表达升高,并且与OA的发生发展程度成正相关。2.通过ACLT模拟的SD大鼠膝关节OA模型中,TESC表达升高,并且与OA的发生发展程度成正相关。3.通过腺病毒敲减SD大鼠原代软骨细胞中TESC的表达,能够缓解IL-1β处理的软骨细胞OA变性,包括细胞外基质合成代谢指标升高、分解代谢指标降低和凋亡被抑制。4.通过膝关节腔注射腺病毒敲减SD大鼠膝关节软骨组织中TESC的表达,通过ACLT模拟的关节软骨OA变性得到改善,包括软骨基质合成代谢指标升高、分解代谢指标降低和软骨破坏减少。5.在IL-1β处理的SD大鼠原代软骨细胞中,TESC通过激活ERK1/2信号通路并使其激活,促进软骨细胞的OA变性。