【摘 要】
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第一部分靶向抑制PHGDH表达对骨肉瘤细胞生物学行为、成骨分化的影响目的:靶向抑制3-磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH）探讨其对人骨肉瘤细胞生物学行为及成骨分化的影响。方法:（1）运用qRT-PCR及Western blot法验证在正常人成骨细胞h FOB1.19和不同恶性程度人骨肉瘤细胞TE85、MG63、143B中PHGDH基因的表达;（2）感染PHGDH干扰RNA慢病毒的人骨肉瘤细胞作为实验组（
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第一部分靶向抑制PHGDH表达对骨肉瘤细胞生物学行为、成骨分化的影响目的:靶向抑制3-磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH）探讨其对人骨肉瘤细胞生物学行为及成骨分化的影响。方法:（1）运用qRT-PCR及Western blot法验证在正常人成骨细胞h FOB1.19和不同恶性程度人骨肉瘤细胞TE85、MG63、143B中PHGDH基因的表达;（2）感染PHGDH干扰RNA慢病毒的人骨肉瘤细胞作为实验组（sh PHGDH组）,感染空载慢病毒的人骨肉瘤细胞作为阴性对照组（NC组）,未感染病毒的人骨肉瘤细胞作为空白对照组（Control组）,运用qRTPCR检测PHGDH基因的m RNA水平的表达,Westernblot法检测PHGDH蛋白水平的表达,验证PHGDH在骨肉瘤细胞中的抑制效果;（3）运用CCK-8、Ed U染色法和Western blot法（检测PCNA的表达）,检测骨肉瘤细胞增殖能力;在体内实验中,运用异位成瘤法,运用体外活体成像技术观察肿瘤大小;（4）运用DAPI染色法检测骨肉瘤细胞凋亡,运用Western blot法检测抗凋亡基因Bcl-2的表达;（5）运用流式细胞术检测敲低PHGDH对骨肉瘤细胞周期分布的影响;（6）运用划痕实验、Transwell实验检测敲低PHGDH对骨肉瘤细胞的迁移能力的影响;（7）运用碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红S染色检测敲低PHGDH对骨肉瘤细胞的早期及晚期成骨分化的影响,Western blot法和免疫组化法检测成骨分化相关基因的变化。结果:（1）与成骨细胞h FOB 1.19相比,在人骨肉瘤细胞TE85、MG63、143B中PHGDH高表达,PHGDH在143B细胞中的表达水平高于TE85、MG63细胞（P＜0.01）;（2）在骨肉瘤143B、MG63及143B-luc细胞中靶向抑制PHGDH进行抗性筛选后,PHGDH在m RNA及蛋白水平的表达较Control组和NC组均明显降低（P＜0.01）,表明敲低PHGDH的人骨肉瘤细胞稳转株构建成功;（3）敲低PHGDH后,骨肉瘤细胞增殖能力明显降低,增殖相关基因PCNA表达明显降低（P＜0.01）;体内实验中,NC组和sh PHGDH组裸鼠均成瘤,sh PHGDH组裸鼠皮下移植瘤体积明显小于NC组;（4）敲低PHGDH后,骨肉瘤细胞凋亡率明显增高（P＜0.01）,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达降低（P＜0.05）;（5）敲低PHGDH后,骨肉瘤细胞G0/G1群体的增加和S期、G2/M期细胞群体减少（P＜0.01）;（6）敲低PHGDH后,划痕愈合率明显降低（P＜0.01）,且Transwell实验细胞穿膜数也明显减少（P＜0.01）;（7）诱导骨肉瘤细胞成骨分化,敲低PHGDH后,ALP染色阳性增加,茜素红染色示钙盐结节明显增多;成骨分化相关基因Runx2、OC、OPN的表达增高。结论:PHGDH的表达水平与骨肉瘤细胞的恶性程度呈正相关;PHGDH促进骨肉瘤细胞的体外增殖和体内生长;PHGDH抑制骨肉瘤细胞的凋亡,促进骨肉瘤细胞的迁移和周期进程;PHGDH降低骨肉瘤细胞的成骨分化能力。第二部分靶向抑制PHGDH对骨肉瘤能量代谢的影响及其机制研究目的:靶向能量代谢探讨抑制3-磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH）对人骨肉瘤细胞的影响。方法:（1）运用乳酸检测试剂盒测定乳酸;ATP检测试剂盒测定ATP;（2）运用TMRE试剂、Mito Traker-red试剂、Mito SOX试剂检测骨肉瘤细胞线粒体膜电位、线粒体结构及线粒体ROS水平;（3）运用qRT-PCR检测骨肉瘤细胞中能量代谢相关基因表达。结果:（1）敲低PHGDH后,乳酸降低（P＜0.01）,ATP增多（P＜0.01）;（2）敲低PHGDH后,线粒体膜电位降低（P＜0.01）,线粒体形态发生变化,线粒体ROS荧光强度增强;（3）敲低PHGDH后,能量代谢相关基因（GLUT1、PFK1、PKM2、LDHA）的表达下调（P＜0.01）。结论:PHGDH促进骨肉瘤细胞的糖酵解,抑制骨肉瘤细胞通过氧化磷酸化产生能量,可改变骨肉瘤的能量代谢模式。
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