【摘 要】
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黑腹果蝇唐氏综合征细胞粘附分子1(Dscam1)作为哺乳动物DSCAM的同源基因,理论上可以通过4个可变外显子簇的互斥剪接编码38,016种不同的蛋白质亚型。Dscam1通过嗜同性相互作用介导自我排斥,每个细胞随机表达几十种Dscam1亚型,由此为神经元提供了不同身份,在神经回路组装中至关重要。以前的研究表明,在Dscam1组成型外显子5和第一个可变外显子6之间的内含子中存在一个保守元件,称作锚定
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黑腹果蝇唐氏综合征细胞粘附分子1(Dscam1)作为哺乳动物DSCAM的同源基因,理论上可以通过4个可变外显子簇的互斥剪接编码38,016种不同的蛋白质亚型。Dscam1通过嗜同性相互作用介导自我排斥,每个细胞随机表达几十种Dscam1亚型,由此为神经元提供了不同身份,在神经回路组装中至关重要。以前的研究表明,在Dscam1组成型外显子5和第一个可变外显子6之间的内含子中存在一个保守元件,称作锚定位点,这一顺式作用元件的核心序列在昆虫中高度保守。每个可变外显子6上游存在选择序列,锚定位点可以和选择序列互补配对,介导可变外显子6的互斥剪接。虽然此调控机制解释了可变外显子6剪接的互斥性,但是其生物学功能还未完全清楚。本文通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了Dscam1基因外显子6簇锚定位点及其下游不同长度敲除的4种果蝇突变体,命名为Dscam1ΔD1、Dscam1ΔD2、Dscam1ΔD3和Dscam1ΔD4。转录水平RT-PCR检测显示,4种突变体果蝇外显子6簇并没有出现明显跳跃剪接现象。蛋白水平Western blot检测显示突变体Dscam1蛋白表达量与野生型基本相同。通过比较4种突变体与野生型果蝇在生长发育、繁殖、生存、运动、对抗绿僵菌感染和神经系统发育等方面的表型,研究锚定位点在果蝇中的生理功能。生长发育结果显示,4种突变体果蝇各发育阶段存活率受到不同程度影响。除Dscam1ΔD3外,突变体孵化率都明显下降,除Dscam1ΔD1外,羽化率都明显下降,而蛹化率只有敲除了外显子6.1的Dscam1ΔD4下降显著。繁殖实验表明,4种突变体雌性5天平均产卵量大约只有野生型的一半。生存实验表明,4种突变体相比野生型表现出不同程度的寿命缩短,但是与野生型一样,雌性寿命比雄性长。然而突变体的运动能力和野生型无显著差异。绿僵菌感染实验结果显示,4种突变体对抗病原菌的能力都显著下降。免疫荧光染色显示,突变体成虫脑部蘑菇体神经元形态未出现明显异常,三龄幼虫表皮中I类树突分支神经元的自我回避能力没有受影响,但是I类和III类树突分支神经元的树突共存交叉点数显著减少。总而言之,本研究发现了Dscam1基因锚定位点对于果蝇的重要生理作用,为锚定位点与选择序列形成的RNA二级结构在果蝇生存、发育、繁殖中所起的重要作用提供了证据,拓展了研究者对Dscam1可变剪接调控机制和生物学功能的理解。
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